rHDL的综述.docVIP

rHDL的起源，制备及用途 摘要：HDL即高密度脂蛋白，为血清蛋白之一。由于可输出胆固醇促进胆固醇的代谢，作为动脉硬化预防因子而受到重视。人们设想通过注射HDL 治疗新血管疾病，于是研究人工重组制备HDL。apoA-I有人源的和基因工程来源的，重组方法有超声法和脱氧胆酸钠法两种。现在，人们又研究出具有不同功能的rHDL,如通过连接突变型apoA-I中和内毒素，通过载上药物进行靶向治疗，通过荧光标记诊断疾病。未来，rHDL将会有更广泛的应用。 关键词：rHDL 心脑血管疾病 临床应用 正文： rHDL,即人工重组高密度脂蛋白，是将载脂蛋白A-I和卵磷酯按照一定比例重组形成复合物，通过生化手段模拟HDL亦称为a1脂蛋白。注射HDLHDL需要从血液中提取获得，大规模的制备具有一定的难度。同时，生物安全性问题以及提取的代价过高也限制了天然HDL作为药物的发展潜力。重组HDL（reconstituted HDL，rHDL）由内源性分离或体外合成的apoA-Ⅰ与磷脂酰胆碱在体外重组形成，在生化特性和功能上与内源性HDL类似，拥有天然HDL多种特性。 早在1985 年，就有莫斯科的科学家们报告说,他们合成了一种具有与天然HDL相似物理化学特性的脱辅基蛋白A-1/卵磷脂/胆固醇复合物,它具有抗人类动脉粥样硬化形成的作用并可能作为从动脉壁去除胆固醇的一种清除剂。用从人主动脉粥样硬化病变的脂肪条和斑块提取出来的酶处理培养平滑肌细胞的研究中,天然的HDL和合成的复合物都能明显降低培养细胞中胆固醇酯的水平。〔1〕 2.rHDL的制备 2.1原料来源 rHDL的制备主要原料为载脂蛋白A-I和卵磷酯。其中，卵磷脂较容易获得，既可以购买大豆卵磷脂，也可以从新鲜鸡蛋中提取蛋黄卵磷脂。相反，apoA-I的来源是解决影响rHDL工业化生产的一个重要因素。apoA-I 可分别从人血浆、组分FⅣ分离提取到人源apoA-I 和利用基因工程制备apoA-I。 人源 apoA-Ⅰ的制备方法一般依赖高速离心机，即高速离心形成密度梯度得到粗HDL, 再进一步纯化得apoA-Ⅰ。其他的如Scanu 等采用离子交换柱法，Jacqueline AR 等采用SephadexG-200 和Sepharose 6B 色谱层析法, Sherman 等采用疏水层析法，王克勤等采用大柱电泳法，Burstein 等采用金属离子法，陈宝生等采用层析聚焦法来提取人血浆中apoA-Ⅰ 。此外,采用丙酮分级沉淀-氯化锰法可从血制品厂白蛋白工艺废弃组分FⅣ沉淀中提取apoA-I，从而有利于血液的综合利用。 由于目前血源短缺以及采用血制品容易引起的病毒感染，利用基因工程获取apoA-I 可以克服这一难题。国外Pyle 等报道了大肠杆菌原核表达apoA-I。国内的钟江教授等报道了昆虫杆状病毒表达了apoA-I,宋大新教授通过毕赤酵母菌真核表达体系表达apoA-I。实验证明,这三种来源的apoA-I无论在理化性质还是生物学活性上都极为接近。 2．2 重组方法 HDL 是体内天然存在的一种广义脂质体，脂质体的制备方法有乙醇注入法、乙醚注入法、钙融合法、反相蒸发法，挤压法、冻融法等。但重组HDL需引进apoA-I ，以上方法均不适合。现在主要的制备方法是超声法、脱氧胆酸钠法。2.2.1超声法 2．2.1.超声法 起初人们多选用超声法制备重组HD超声法制备重组HDL。方法是先用有机溶剂将卵磷脂10溶解，接着在水浴中旋转减压蒸发，形成成薄膜并以氮气流吹尽残余有机溶剂。再加入PBS 缓冲液和apoA-I 溶液，在冰水浴中进行超声。最后采用柱层析等方法分离纯化，除去未包被apoA-I。但这种方法制备的复合物粒径较大（200nm），且不均匀，大小不易控制，超声过度会破坏蛋白质。 脱氧胆酸钠法 第一步与超声法相同，也是先制备薄膜。第二步在重组时加入脱氧胆酸钠的1/20 PBS 和apoA-I 溶液，将薄膜溶解充分混匀后于24oC 水浴中摇荡30min代替超声的操作。这样制备出来的脂质体大小均匀，呈圆球形，通过改变脱氧胆酸钠与卵磷脂的重量比，还可以控制复合物的大小(脱氧胆酸钠与卵磷脂重量比增大，平均粒径明显变小)。同时该法的复合物由于粒径较小，可以做到约20nm,接近天然的HDL,容易被细胞膜受体识别，更适合于临床应用。另外该法制备条件温和，容易操作，无需昂贵设备，有很好的应用前景。〔2〕 超声法制备的rHDL 脱氧胆酸钠法制备rHDL 的电镜照片（×5,2000） 的电镜照片（×5,2000） 2.3．rHDL的检测及保存 除了利用电镜观察形态结构外，rHDL可经柱层析分析纯度，通过B