增殖与组培继代培养.docVIP

一、继代培养 1. 培养物 再培养的或从初代培养新生长的组织或器官称为“培养物”。在初代培养的基础上所获得的培养物如愈伤组织、芽、胚状体和原球茎等，数量都还不太多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从面发挥快速繁殖的优势。 2. 继代培养 把初代培养所获得的培养物，移植到新的培养环境，这种移植操作经过多次反复的培养，就叫继代培养，又叫连续培养。依移植操作的次数分别称为第 1 次继代培养、第 2 次继代培养 …. ，连续多代的培养又被称为建成培养。其目的旨在繁殖出相当数量的无菌芽（苗）。继代培养的后代是按几何级数量增加的过程。 3. 继代培养中扩繁的方法，包括切割茎段、分离芽丛、分离愈伤组织、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。 增殖使用的培养基对于某一种植物的培养物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖。 继代培养是经常性不停的进行过程。在达到相当数量之后，应考虑使其中大部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。 二、继代方法 1. 固体培养 有利于器官的分化。 2. 液体培养 以原球茎或胚状体方式增殖时，如兰花中增殖后得到的原球茎，分切后进行振荡培养（ 22 恒温，连续光照）即可获得大量的原球茎，再切成小块转入固体培养基中，即可得到大量小苗。 在快速繁殖中，增殖培养有时采用浅层液体静置培养，生根阶段再采用固体培养基，以节省成本。 三、提高增殖速度的方法 1. 改进培养基 历来使用的培养基大多为培养细胞、愈伤组织和根等设计的，无机盐浓度较高，对一些植物茎尖、芽的生长不一定合适。一方面可参考已有资料或相关的报道，一方面进行多种实验找出最佳培养基。 GR 在增殖培养中所起的作用往往是决定性的，但是报道差异很大。现将带普遍性的结果总结如下： （ 1 ）细胞分裂素类 通常高浓度会抑制茎芽的发生，如竹节海棠在 6-BA2-3mg/L 时，几乎不能生长，至 0.5 mg/L 后能逐渐恢复正常的分化出苗和生长；月季在 6-BA 太高时，茎芽增殖成短密的丛生芽，生长几乎停止。但是，细胞分裂素的浓度也不能太低，否则没有侧芽出来，会愈伤组织化。无菌短枝型增殖，因为不存在顶端优势，有时不加细胞分裂素或在 0.1 mg/L 以下也可。 但在天南星科植物如万年青、花叶芋、红掌、绿巨人、绿霸王等的组织培养中，愈伤组织的诱导和丛芽的增殖都需要 6-BA2-3 mg/L ，甚至 5 mg/L 的浓度。在香蕉、粉蕉的组织培养中也使用高浓度的 6-BA 。但浓度不宜过高，否则器官分化能力下降，且使遗传变异增加。 （ 2 ）生长素类 一般双子叶植物要求较低的浓度，如果浓度高会抑制芽的形成。如 NAA 使用的浓度，秋海棠为 0.2mg/L ，菊花 0.2-1mg/L ，月季 0.01-0.2mg/L ，倒挂金钟 0.5-1 。 单子叶植物要求的较高，如朱蕉 2,4-D2-3mg/L ，萱草 2,4-D2mg/L ，水仙 NAA15mg/L ，虎尾兰属植物 NAA6-10mg/L 。 （ 3 ）赤霉素 可能参与细胞的增殖，促进芽的形成和生长。在菊属、拟南芥属植物中，加入 GA 3 可促进芽的分化，因为其内源 GA 3 水平低的缘故；在烟草、秋海棠和水稻的组织培养中，对茎芽的分化有抑制作用，特别是在类分生组织时期最为明显。如烟草正在分化的愈伤组织在黑暗条件下， GA 3 处理 30-60min ，减少芽的分化， 48hr 后所有的类分生组织或茎芽消失。 （ 4 ）脱落酸 ABA 能部分克服烟草中 GA 3 引起的对芽形成的抑制作用，红薯中加入 ABA 能促进芽的分化，可能是其内源 GAs 超过了阀值。 PGR 对器官分化的影响可见图 8-1 的总结。 其他培养基组分和附加成分也有影响。如烟草培养中， PO4-3 可以抵消 IAA 对芽的抑制作用，无论腺嘌呤或 KT 存在与否都能促进器官的分化；水解酪蛋白能提高 KT 诱导芽分化的作用，特别是当 IAA 浓度高时，酪氨酸可代替水解酪蛋白的作用。 2. 改善培养条件 见第 章。 四、继代培养中分化能力下降的因素及解决措施 在植物组织继代培养中，有些植物种类能良好地继代，如马铃薯、非洲紫罗兰、香石竹、菊花和花叶芋等，而另外一些则不能，如杜鹃、瑞香、大蒜等，分化能力衰退。主要原因及对应措施有： 1. 生理原因 培养过程中逐渐消耗了母体中原有与器官形成有关的特殊物质，不同植物保持分化能力差异很大，如禾本科植物、植物单倍体不易再生，更难保持。 对策：加入腺嘌呤或酪蛋白等物质后，器官