杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白88在鞭毛组装过程中的功能分析及其原核表达.pdfVIP

JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences) Mar． 2013 Vo1．48 No．2 doi：10．3969／j．issn．1671：6825．2013．02．007 杜 氏盐藻鞭毛 内运输蛋白88在鞭毛组装过程 中的功能分析及 其原核表达 韩 康¨，石 科 ，毛丽红¨，李庆华 ，龚方华 ，蒋海丽¨，薛乐勋 1)郑州大学生物工程系细胞生物学研究室 郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院细胞生物学研究室 郑州 450052 #通讯作者 ，男，1944年2月生 ，本科 ，教授 ，研究方 向：肿瘤标志物与基 因工程 ，E—mail：xuelx@ZZU．edu．en 关键词 杜氏盐藻 ；鞭毛 内运输蛋 白88；鞭毛再生 中图分类 号 Q781 摘要 目的：克隆杜氏盐藻鞭毛内运输蛋 白(IFT)88的cDNA全长并分析其部分功能。方法 ：根据盐藻转录组测 序片段 ，分别设计其 3’端内、外侧 引物及 5’端内、外侧 引物 ，PCR扩增其全长。提取盐藻再生过程中不同时间段的总 RNA，逆转录后进行实时荧光定量 PCR，检测 IFT88mRNA的表达情况 。随后利用 ORFfinder预测并扩增其开放阅读 框 ，连接到 pET28a载体上 ，转化大肠杆菌 BL21(DE3)，并在 1mmol／LIPTG、37℃的条件下诱导4h，提取总蛋 白，聚丙 烯酰胺凝胶 电泳(SDS—PAGE)检测 IFT88蛋 白表达情况。结果：克隆拼接后共得到开放 阅读框 2400bp，编码 799个 氨基酸。BLAST显示该氨基酸序列与多个物种的IFT88有较高同源性 。SDS—PAGE结果显示 ，与未诱导组相 比，诱导 组在90000左右有一条 明显的条带。在鞭毛再生过程 中，杜 氏盐藻 IFT88mRNA的表达量在去鞭毛后 30min左右时 最高，随后快速下降。结论 ：扩增得到杜 氏盐藻 IFT88cDNA序列且 IFT88可能参与盐藻鞭毛组装。 Functionalanalysisofintraflagellartransportprotein88 from Dunaliella salina duringflagellarregenerationanditsprokaryoticexpression HAN Kang¨ SHIKe ，MAO Lihong¨ LIQinghua ，GONGFanghua ，JIANGHaili ，XUELexun’。’ ， ， J)LaboratoryforCellBiology，DepartmentofBioengineering，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 2)LaboratoryforCellBiology，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052 Keywords Dunaliellasalina；intraflagellartransportprotein88；flagellarregeneration Abstract Aim ：Toanalyzefunctionofintraflagellartransportprotein (IFT)88fromDunaliellasalina．Methods： TheIFT88cDNA wasclonedusingdesigned3’and5’inner／outerprimersbasedonthenucleotidesfragmentsaccordingto theflagellarregenerationtranscriptomesequencing．ThetotalRNA ofcellsatdifferenttimeafterdeflagellationwasextracted andreversely transeripted．ThenthetranscriptionalexpressionofIFT88wasobservedbyreal—timefluorescencequantitative PCR．TheopenreadingframewaspredictedusingORF finderandthenwasclone