csj酵母制片与简单染色.docVIP

酵母的培养和制片 摘要：实验用酵母合成培养基和麦氏琼脂培养基斜面对酿酒酵母进行培养，用美兰染色，观察到酵母的形态和出芽状况，比较了3min及30min时菌体死活比例；用孔雀绿和番红进行复染，观察到了子囊孢子。 关键词：酵母 出芽 死活细胞 子囊孢子 前言：单个酵母的个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大多数采取出芽方式进行繁殖，也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。由于细胞个体大，采用涂片法可能损伤菌体，一般采用美兰染液水浸法制片观察酵母形态。美兰染液水浸法可以鉴别酵母细胞的死活。美兰对细胞无毒，其氧化型蓝色，还原型无色，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。 1材料和方法 1.1 材料 1.1.1菌种 酿酒酵母 1.1.2 溶液、试剂和仪器 无菌水 0.1%稀释美兰 孔雀绿 番红 95%乙醇 酵母合成培养基 麦氏琼脂培养基 普通光学显微镜 镊子 载玻片 盖玻片 酒精灯 接种环 滴管 试管夹 表1酵母合成培养基配方 项目 水 酵母膏 葡萄糖 蛋白胨 PH 用量/g 100mL 0.5 2 1 自然 1.2方法 1.2.1培养基配制及接种 1.2.1.1配制酵母合成培养基和麦氏琼脂培养基各100mL。将液体培养基分装到三个三角瓶中，每瓶20-30mL，麦氏琼脂培养基分装到十个试管中。 1.2.1.3将分装好的液体培养基和麦氏琼脂培养基包扎好，在115℃下灭菌30min。 1.2.1.4无菌操作在液体培养基和斜面上接种酿酒酵母，27℃培养7天。 1.2.2美兰染液水浸片法 1.2.2.1滴加稀释美兰于载玻片中央，于酿酒酵母合成培养基中蘸取少量菌体置于染液中混合均匀。 1.2.2.2用镊子去一片盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。 1.2.2.3低倍镜镜检：隔3min和30min分别镜检，比较其菌体死活比例。 1.2.3子囊孢子染色 1.2.3.1制片：常规方法从产孢斜面上取菌涂片、干燥及固定。 1.2.3.2孔雀绿初染：向载玻片上滴加数滴孔雀绿染液覆盖涂菌部位1-1.5min，可稍微加热以便上色。 1.2.3.3自来水冲洗至流出的水无色，加95%乙醇脱色30s，自来水冲洗。 1.2.3.4番红染色0.5-1min，水洗后自然干燥，显微镜镜检。 2结果与分析 2.1实验结果 美兰染色可以看到视野中有蓝色和无色相间的菌体，分别为死去的和活着的菌体，3min时活菌数目较多，30min时死菌数目明显增多。菌体边紧连有比菌体小的芽，都呈圆或椭圆形。 子囊孢子染色可看到红色菌体和绿色的四个一起的子囊孢子，也有三个、两个一组或单个散落的孢子。 死细胞 死细胞 芽 活细胞 活细胞 图1美兰染色3min（*400） 图2美兰染色30min（*400） 菌体 子囊孢子 子囊孢子 图3孢子染色（*400） 图4孢子染色（*400） 2.2结果分析 稀释美兰对菌体仍有刺激，随时间增加死菌数目增多。子囊孢子为四个一组被子囊包裹，由于互相遮挡会呈现三个、两个一组，也有子囊破裂而散落成单个的。酵母菌体较大涂片法制片对酵母细胞有损伤，使子囊孢子大量散落胞外。 3小结 本次实验比较成功，实验过程中熟悉了培养基制备及无菌操作；观察了解了酵母形态及孢子形态特征，学会了鉴别菌体死活。染色时注意脱色要彻底，否则绿色残留使菌体与孢子分别不明显，番红复染也要把握时间，否则菌体颜色过浅。 参考文献 沈萍，陈向东. 微生物学实验【M】. 4版. 北京：高等教育出版社，2007.