实时荧光定量PCR概要.pptx

实时荧光定量PCR;内容概要;实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析; 扩增曲线 荧光阈值 Ct值;;;Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数;Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性;理想的PCR反应;非理想的PCR反应;在扩增产物达到荧光阈值时;Cycle number;线性关系、扩增效率确认;内容概要;非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe ;;热 变 性;问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 ;将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确; 使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势;Taqman探针法——原理;;1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素； 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应