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浙江大学硕士学位论文 吡格列酮对外周血内皮祖细胞数量与增殖能力的影响 浙江大学医学院 内科学(心血管系) 2006级硕士研究生周文静 导师 张芙荣 【摘要】 目的： 观察吡格列酮对外周血内皮祖细胞(Endothelial progenitor 密度梯度离心法从外周血获得单个核细胞，将其接种于包被人纤维连 接蛋白的培养板上，培养14天后收集贴壁细胞，加入不同浓度 染色阳性细胞为正在分化的EPCs，并在倒置荧光显微镜下计数。然后 在作用时间48h、 采用MTT比色法来观察EPCs的增殖能力。结果： 72h后，不同浓度的吡格列酮均增加了外周血EPCs数量和增殖能力； EPCs数量明显高于对 10—5咖ol／L吡格列酮作用48h时影响最为显著， vs 照组(54．O±2．9 vs ±O．033O．178±O．018，PO．01)。结论：吡格列酮可增加EPCs 数量并改善EPCs的增殖能力。 【关键词】吡格列酮；内皮祖细胞；细胞培养；动脉粥样硬化；糖 尿病。 一1一 activated 床上主要用于治疗2型糖尿病。临床上糖尿病患者的冠脉病变更为严 重，心血管系统的并发症是糖尿病患者的主要死亡原因之一n1。内皮 损伤是贯穿冠心病发生和发展的重要过程乜’31。研究也表明内皮障碍 与糖尿病心血管事件发生的关系十分密切h5’6’71。内皮祖细胞 (Endothelial cells ProgenitorEPCs)是能直接分化为血管内皮细 胞的前体细胞，不仅参与胚胎血管生成，而且发现其也参与出生后的 血管新生和内皮损伤的修复，对冠心病及糖尿病心血管并发症的发 生、发展可能起着重要作用H’5’6’。近来的研究发现PPARl激动剂不 仅有调节代谢作用而且有心血管保护及抗动脉粥样硬化的作用随1。有 临床研究报道吡格列酮能增加冠心病及糖尿病患者外周血内皮祖细 胞数量和功能的作用西’1训，但吡格列酮对内皮祖细胞的直接影响报道 尚少。本研究就吡格列酮对人外周血内皮祖细胞的数量和增殖能力的 影响进行了研究。 l材料与方法 1．1材料与试剂吡格列酮购自Cayman公司；含双抗的M199及 Probe公司；胎牛 的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL—Dil)购自M01ecular 血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；二苯基四氮唑溴盐(MTT) 购白华美生物工程公司(进口分装)：1：250胰蛋白酶购自上海生工 生物工程技术服务有限公司；血管内皮生长因子(vascular 一2一 浙江大学硕士学位论文 endothelial growth 离液购自上海试剂二厂。 1．2方法‘111 1．2．1EPC的分离及培养 取健康志愿者成人外周血20m1， 采用密度梯度离心法获得单个核细胞，将其接种在有人纤维连接蛋白 包被的培养板上。M199培养基(含20％胎牛血清，VEGF50n∥mL， 液继续培养至14d，洗掉非贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。 1．2．2吡格列酮溶液的配置 粉末若干，称量后置于DMSO中，磁力搅拌器上摇匀，待完全溶解后， 置室温保存，使用时用M199稀释到各所需浓度。 1．2．3实验分组贴壁细胞随机分成5组，每组6孔，一组为对照 组(正常培养组)，其余4组分别加入含 各组分别培养24h，48h，72h。 confocal scanning 本在37℃下孵育1h。激光共聚焦显微镜(Laser 性细胞为正在分化的EPCs，在倒置荧光显微镜下每孔计数取平均值 (计数10个随机选择的×200视野EPCs)。