重组质粒酶切与PCR验证.docVIP

重组质粒的酶切和PCR验证 学习和利用限制性内切酶酶切检验重组质粒插入片段的方法； 复习限制性内切酶酶切原理和方法； 学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术； 学习利用PCR方法检验重组质粒插入片段的方法； 了解引物设计的基本要求； 【实验原理】 1、重组质粒是外源基因通过单酶切与用相同的限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。 2、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），即PCR技术是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。’端掺入dNTP合成新的DNA互补链，产生新的双链DNA。 3、PCR反应有两个重要特征：一是经PCR扩增后，扩增产物片段在大小由两个引物与模板的结合位点决定；二是经过PCR扩增，产物以指数级数增加，可达到目的片段的大量扩增。在此实验中PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 ’端避免超过3个连续的G或C，否则会使引物在G+C富集区产生错误引发。 C．单条引物内部避免有二级结构，引物自身不能有连续4个碱基的互补。 D.两条引物之间最好不能有超过连续4个碱基的互补，3’端不存在互补序列，还要避免3’端的G碱基串和C碱基串。 E.引物序列最好由1-2个G或C碱基起始，也以1-2个G或C碱基结束。 F.熔解温度：Tm是寡核苷酸的解链温度，即在一定的盐浓度下，50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR反应中的有效复性启动温度，一般低于Tm 5-10℃。 G.两个引物应当具有相近的Tm，相差应小于5℃。因此，上下游两个引物之间长度应相差小于3bp。 H.引物的5’端可以被修饰，对扩增的特异性影响不大。 I.引物3’端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3’端开始的。 J.在扩增基因编码区域是，引物3’端要避开密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性和效率。 5、标准PCR的基本程序为：模板DNA的预变性 25-35次循环 产物的终延伸。预变性的目的是为了在开始PCR循环之前，使模板DNA充分地变性。终延伸步骤的目的是为了使在最后一次循环中起始的合成片段都能够完成延伸。 6、反应： （1）变性（denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。温度一般情况选择94，30秒可使各种复杂的DNA分子完全变性。在本实验中，根据选择的模板，选择3min的变性时间。 （2）退火（annealling）：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。复性温度的选择，可经根据引物的长度和其G+C含量确定，在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性。退火时间设置为30秒钟，足以使引物和模板之间完成结合。 （3）延伸（extension）：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg离子存在的条件下，5＇-3＇的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。PCR反应的延伸温度建议选择在70～75之间，实验中选择72。 以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106～7拷贝。理论上说20～25次循环后，PCR产物的积累即可达最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20～30次是比较合理的循环次数。循环反应的次数越多非特异性产物的量亦会增加。 λ-Hind Ⅲ DNA Marker，pUC19/ Hind Ⅲ DNA Marker， DL2000 plus DNA Marker，ddH2O，Hind Ⅲ，Taq DNA 聚合酶，缓冲液，dNTP混合物 2、实验仪器：37℃恒温水浴锅，PCR仪，-20℃冰箱，1.5mL离心管，不同型号枪头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，一次性手套，凝胶成像仪 【操作步骤】 重组质粒的酶切验证 根据之前重组质粒电泳图判断我组插入片段大小约为6.5kb和2.0kb，采用Hind Ⅲ酶切进行验证。我组重组质粒R1较大且数目较多，R2片段中等产量中等，设计酶切反应体系如下： 成分及加样顺序 重组质粒R1 体系（μL） 重组质粒R2 体系（μL）