基因转染技术和其应用简介.pptVIP

基因转染技术及其应用简介; 报告内容;;二、基因转染的基本方法;(一)重组子构建; (1)目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法 ;;B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因 a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知） → 设计/合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板) → 从组织或细胞制备目的基因 b. 构建RT/PCR文库法获取未知基因 据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 → 将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→ 构成PCR－cDNA文库筛选;;2.哺乳动物细胞表达载体的选择;;;;3.DNA片断的重组连接;4. DNA重组体的鉴定;; 对外源基因转染方法的要求包括：转移效率高，不影响细胞的正常生理活动，低毒性，容易使用，重复性好，易获得稳定转化子。根据转染的机制不同可将转染法分为： 1.化学转染法 2.物理转染法 3.病毒感染法 ;1.化学转染法;2. 磷酸钙共沉淀转染法 由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙混合，然后加人到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作用摄人DNA。 3. 人工脂质体法 脂质体还可以介导DNA和RNA转动物和人的体内，用于基因治疗。人工合成的阳离子脂质体与带负电荷的核酸结合后形成合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内。;2.物理方法;;3.病毒感染法;三、基因转染技术的应用;（一）转基因植物;1.转基因植物的发展简史;2.转基因植物类型;（二）转基因动物;转基因动物疾病模型;;（三）生物制药;动物乳腺反应器;（四）基因治疗;;（五）RNAi技术;RNAi;一 、 RNAi早期研究和理论形成 ;2.秀丽线虫实验;3.粗糙脉孢菌实验 ; 早期的三个实验，牵牛花实验和粗糙脉孢菌实验已经做出了有意义的结果，但都没有继续研究。 其中以秀丽线虫实验有最有意义???因为在这个实验中给线虫注射了正义RNA和反义RNA，但就是没有注射二者结合起来的双连RNA。而RNAi理论形成的形成正是基于后者。;（二）RNAi理论形成;Discovery of RNAi; 1.RNAi理论;2. RNAi概念;二.参与RAN干扰的重要分子;（一）Dicer酶;（二） RISC ;（三）RdRP和mRNA;三、RNAi作用机制;;谢 谢 !