01第一章_生物化学技术原理和应用.ppt

;第一章 生命大分子物质的制备;生命大分子物质通常是指： 动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。 生命科学研究将进入后基因组时代。分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。 本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(这部分移至后面的章节介绍)等步骤。 ;第一节 材料的选择与处理 ; B.有效成分在材料中存在的特点 有效成分的含量一般较少 如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。 有效成分稳定性较差 大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。 选用的材料不同，有效成分的含量就不同； 选用的材料即使相同，但是部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。 ; C.材料选择应遵循的原则 有效成分含量多、稳定性好 来源丰富、保持新鲜 提取工艺简单 有综合利用价值等 ; 二、材料的处理 选择到合适的材料后，应及时使用，或采用冰冻或干燥等方法处理。 同时还应将易于去掉的非需物质除去。 ; 1 动物脏器 (1)冰冻 应在很短时间内置-10℃冰库(可短期保存)或-70℃低温冰箱(数月不变质)贮存。 脱脂 脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。 一般脱脂的方法有： A.人工剥去脏器外的脂肪组织； B.浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂； C.采用快速加热(50℃左右)、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去； D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。; (2)干燥 A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用； B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。; 2 植物组织 A.叶片 用水洗净即可使用； 或在l0h内置-4～-30℃冰箱贮藏备用。 B.植物种子 需泡胀或粉碎才可使用。 材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。 ; 3 微生物 为制备生命大分子物质的主要材料之一。 用离心法收集到的上清液， 可用于制备胞外酶和某些辅基???有效成分； 可置低温下短时间贮存。 收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分； 或制成冻干粉，在4℃保存(数月不会变质)。;第二节 确立测定方法 ;二、常用的测定方法 1.光谱法 2.电化学法 3.生物活性检测法 4.免疫分析法 5.生物传感器; 1 光谱法 (1)吸收光谱法[①直接测定法；②比色法] (2)荧光法 (3)浊度法 特点： 测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值； 且操作简单，反应迅速、灵敏； 结果也较准确， ; (1)吸收光谱法 直接测定法、比色法 ①直接测定法 将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中， 即可从测定的消光值换算出待测物的含量。 ; A.测定核酸含量 构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。 在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低，二者之间成正比关系。; 通常1个A260值分别相当于 双链DNA 50μg／ml 单链DNA 37μg／ml 单链RNA 40μg／ml 用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度： 纯DNA比值为1.8 纯RNA的比值为2.0 当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。 ; B.测定蛋白质的含量及纯度 蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。; ②比色法 将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产物特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。 例如： 邻苯二酚(在275nm有吸收峰) + 邻苯二酚-2,3-双加氧酶 黄色的α- 羟基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰) 通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活力。 ; 还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度 例如 纯细胞色素