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聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 体外程序化的DNA合成技术。 PCR 原 理： 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 3）反应程序： PCR扩增 PCR特点及应用 特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物;  （PCR allows rapid replication of a single copy  of DNA into millions of copies）. PCR特点及应用 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。 PCR应用 基因组DNA分析 genomic assay 克隆基因或基因片断 Cloning of genes or gene fragments 遗传病的诊断 Genetic diagnosis 亲子鉴定 Paternity testing 反转录PCR Reverse transcription (RT)-PCR 犯罪现场的法医分析 Forensic analysis at scene of crime 传染病的分析 Assays for the presence of infectious agents 遗传病的产前诊断 Prenatal diagnosis of genetic diseases 体外突变与DNA工程 In vitro mutagenesis and engineering of DNA 等位基因序列变化的分析 Analysis of allelic sequence variations PCR反应中的成份 1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长浪费。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布，在3‘端避免连续3个G或C,因这样易导致错误引发。 (4) 引物3端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 3. Mg2+： Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。 4. 模板： PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状也可以是环状分子。模板影响PCR的主要因素是数量和纯度。一般对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5. Taq DNA聚合酶： 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚