血红蛋白和核黄素凝胶层析分离电液.pptVIP

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离电液;实验目的;层析技术;实验原理;血红蛋白与核黄素;凝胶层析;凝胶层析示意图;交联葡萄糖凝胶;Sephadex G-25凝胶层析实验器材与试剂;柱层析的基本装置示意图;实验操作;（4）平衡。 装好后，使层析床稳定5~10min,然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速为1ml/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳定. 操作过程中应特别注意：①在平衡与洗脱时要将高位贮液瓶至层析柱的连接管内的气泡全部排出，以免影响流速；②恒压高位贮液瓶内玻璃管底端出口高度之差不能大于40cm，以免影响流速；③平衡过程中务必防止层析床液体流干。防止层析床液体流干最简单的方法是使连接高位贮液瓶与层析柱之间的导管形成U形，U形管底部低于层析柱的出口；④如果需要温度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水。; （5??加样与洗脱。 打开平衡好的层析柱低端出口，使柱内溶液流向与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5ml样品的加样滴灌在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后，打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液同样小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后加洗脱液加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始洗脱。注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面，影响分辨率。 （6）收集与测定。 收集时可使用自动部分收集器或手工操作，每管接洗脱液3ml.直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对每管收集液进行光吸收测定。以收集管数（或洗脱体积）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线。 ;[注] 市售凝胶如需彻底处理，可在溶胀后再用0.5mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCL溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避免在酸或碱中加热。另外，用过的凝胶柱如需再生，可用0.1mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCL洗涤以去掉堵住网孔的杂质，然后用蒸馏水洗至中性备有。一般使用几次后就需要再生了。