细菌培养法.docVIP

实验一 细菌的培养法 一般细菌均可用人工方法进行培养，使其生长繁殖，以便进一步观察和研究它们的各种生物学特性。为了获得良好的细菌培养物，在分离培养细菌时，除采用适宜的培养基并考虑到其他的培养条件（如温度、湿度、酸碱度、气体等）之外，掌握各种分离培养和接种的基本技术，也是重要环节。 在土壤、水、空气、以及人和动、植物体中，不同种类的细菌混杂地生活在一起。若要研究其中某种细菌，就必须先将各种细菌进行分离，以得到只含有这一种细菌的纯培养。分离培养细菌的方法有多种，平板划线法即是其中之一。该法主要是借划线而将混杂的细菌在琼脂平板表面分散开，使单个细菌能固定在某一点，生长繁殖后形成单个的细菌集团（即菌落）以达到分离纯种的目的。 当细菌分离成纯种后，常需要接种到有关的培养基中，以测试其各种生物学性状。一般可用斜面、液体和半固体培养基来检验细菌的培养特征，因此接种方法可相应的分为三种。 斜面培养基接种法 常用于细菌的大量繁殖，保存菌种，或观察其某些生化特性。琼脂斜面、尿素培养基、双糖铁培养基、柠檬酸盐培养基等具有斜面外形的固体培养基均可用此法接种。 液体培养基接种法 可用于观察细菌不同的生长状况，有的呈均匀混浊，有的呈沉淀生长，还有的在液体表面形成菌膜；另外还可以供测定细菌生化特性之用。凡是肉汤、葡萄糖蛋白胨水以及各种单糖发酵管等液体培养基均用此法接种。 穿刺接种法 常用于半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基、双糖铁培养基等的接种，前者用于测定细菌的动力，后二者则用于观察细菌的生化反应。 目的要求 1．学习和掌握细菌分离和培养的各种基本技术。 2．进一步熟悉和掌握微生物的无菌操作技术。 材料 1．菌种和培养基 平板划线接种法 斜面培养基接种法 液体培养基接种法 穿刺接种法 菌种 葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液 大肠杆菌培养物 大肠杆菌培养物 枯草杆菌培养物 变形杆菌培养物 痢疾杆菌培养物 培养基* 普通琼脂平板 琼脂斜面培养基 普通肉汤培养基 半固体琼脂培养基 *各培养基的组成及配置方法参见书后附录。 2．接种环、接种针、酒精灯、记号笔、试管架等 方法 平板划线接种法 （1）标记 在培养皿底玻璃上，用记号笔注明接种的菌名、接种者姓名、班级、日期等。 （2）灭菌接种环 点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环并放置火焰中烧灼灭菌，如图1-1，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属环端，再直接烧灼金属环直至烧红，然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向通过火焰，如此2～3次。 图1-1 接种环的灭菌操作 然后将接种环移开火焰，待其冷却。注意，接种环不能距离火焰过远，一般应在距火焰10cm范围之内（视此范围为无菌环境）；灭菌后的接种环不能再碰及他物。 （3）取菌种 左手持装有葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液的试管，用持有接种环的右手手掌及小指拔取试管棉塞，将试管管口迅速通过火焰2～3次进行灭菌。 将已灭菌且已冷却的接种环伸入菌种管中，取一接种环的混合菌液，然后退出菌种管。将菌种管管口再次通过火焰2～3次灭菌，塞好棉塞，放至原来的位置。 （4）分离划线接种细菌（见图3-1） 左手持琼脂平板培养基（将皿盖反放在桌上酒精灯附近），尽量使之直立以免空气中的细菌落入其中，并靠近火焰。右手持接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一细菌薄膜（约占平板面的1/10），视为一区。划线时使接种环与平板面成30～40度角，以腕力在平板表面行轻而快地来回滑动动作。切记，接种环不应嵌进培养基内，避免将琼脂表面戳破。 旋转琼脂平板90度。烧灼接种环，以杀灭环上的残留细菌，将接种环触及培养基表面以使其冷却。灭菌接种环通过薄膜处作连续平行划线（约占平板1/5），此为二区。注意接种环只通过薄膜1～2次，以获取薄膜处少量的细菌。 旋转琼脂平板90度。烧灼接种环灭菌并使之冷却。将灭菌接种环接二区连续平行划线（约占平板1/4），此为三区。接种环只通过二区1～2次以获得少量细菌。 旋转琼脂平板90度。接种环不必再灭菌，接三区连续平行划线，划满平板其余部分，此为四区。 注意各区接种线间尽量互不交接，以达到细菌逐渐稀释的目的。 （5）划线完毕，将琼脂平板放进皿盖，将培养皿倒放（这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落），送进37℃温箱培养。 （6）培养18～24小时后将培养皿取出。观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。 1