限制性内切酶酶切常见问题和解决方法.docVIP

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法 限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。 酶切现问题，看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，。 可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基 ，同尾酶、同裂酶 1. 酶切不开或不完全 1.1 质粒问题 纯度差或残留酶切抑制物最为常见 。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等；【重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂， 1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换] 。 【题外话：用内切酶注意】 a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。 b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。 c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。此外，有时由于操作不小心，冰盒上凝结的一些碎冰掉在酶管里了（我自己出现过两次，汗....） d. 吸取酶时的tips。我们常用来取酶的tips都是最小的那种，适合2ul和10ul的枪，但tips通常有两种，一种是最常用的短的tips，用它取酶时，tips挨着酶液后，枪几乎是要插入管子，有时会在枪身上沾上酶液。因此，可能会产生污染。那么我们必要非常注意动作，要么就换用另一种长的 tips，专门去酶液用。 1.3 buffer问题。有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分[连接酶的buffer更是这样]，有时酶切的buffer没有完全融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时就会出现问题。 1.4 双酶切的buffer选择：确认使用的是正确的buffer和反应温度[具体可以参考各厂家提供的酶切buffer以及双酶切buffer的资料，其中，NEB的可以参见 /cn/tech/re/double_digests.htm 1.5 酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I 等。甲基化主要分为Dam、Dcm和CpG甲基化等。如果是提取的质粒，质粒就会因大肠杆菌的Dam,Dcm被甲基化；如果是直接从哺乳动物细胞中提取的DNA，则部分DNA就会因CG methylase的影响而被甲基化。一些酶切位点被甲基化后，酶切会受影响。因此，出现酶切不开或不全时需要考虑甲基化的问题。甲基化通常出现在特定序列，以Xba I为例，仅当序列位5-【TCTAGA】TC-3时，Xba I的位点才会被甲基化，并非所有的Xba I位点都会出现甲基化。 具体的列表可以参考 /en/gsxw_p.asp?N_id=12 http://bio.takara.co.jp/BIO_EN/catalog_d.asp?C_ID=C0007 /cn/tech/re/alteration.htm 其中，克隆常用的酶切位点见下表： Restriction Enzyme Methylation Sequence Site Methylation Type Enzyme Activity Blocked? AarI 5...CACCTG cG...3 C partially ApaI 5...GGGCC cG...3 C partially ApaI 5...GGGCCc WGG...3 D partially BclI 5-TGaTCA...3 A Completely BglI