细菌鞭毛染色和运动性观察.docVIP

细菌鞭毛染色及活菌运动性观察 【摘要】本实验以铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌为实验菌种，先使用压滴法制片，之后用光学显微镜的油镜观察细菌的活体运动。然后，使用鞭毛染色法（用硝酸银染液A液和B液进行染色）对其染色，之后用光学显微镜的油镜观察细菌鞭毛的形态；虽然最后并没有在显微镜下观察到染色后的鞭毛，但在实验中已大致掌握相关实验操作。 【关键词】铜绿假单胞菌；枯草芽孢杆菌；鞭毛染色法；压滴法 【前言】鞭毛是生长在某些细菌体表的长丝状，波曲型的蛋白质附属物，具有运动功能。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10~20nm，只有用电子显微镜才能观察到。但可以使用鞭毛染色法，使之能用普通光学显微镜观察到。因此在本实验中，要观察细菌鞭毛形态，就要使用鞭毛染色法。本实验使用染液的是硝酸银染液A液和B液。而观察细菌的运动性时要使用压滴法。本实验选用的的菌种是具周生鞭毛的枯草芽孢杆菌和具端生鞭毛的的铜绿假单胞菌，均可使用两种方法进行观察。本实验报告先介绍了本次实验的实验材料与方法，然后是对实验的结果与分析进行描述，最后是总结性的小结部分。 1.实验目的 1.1学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征 1.2巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 1.3学习压滴法观察细菌运动性（活细胞） 实验原理 2．1细菌鞭毛染色法的基本原理 简单染色法适用于一般的微生物菌体的染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如鞭毛，对它们进行观察之前需要进行有针对性的染色。 鞭毛是细菌的纤细丝状的运动器。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10~30nm，只有用电镜才可以直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。 2.2菌种压滴法观察活菌运动的基本原理 鞭毛的功能相当于船的螺浆，在水中可以高速旋转从而推动菌体前行，因此水体环境才是鞭毛细菌自由驰骋的天地。鞭毛的旋转速度是非常快的，每秒钟旋转两百到一千多转，比一般的电动机要快得多。鞭毛的高速旋转是由其附着于菌体上的基体旋转带动的，基体实际上就是鞭毛的基部，它由一个中轴套上两个或四个环构成，镶嵌固定在细菌的体表（细胞膜和细胞壁）中，在科学家的眼中，基体简直就是一台精巧的纳米机械—分子马达，但这个马达并不是靠电流驱动，而是用伴随着细胞膜两侧质子梯度的消失产生的生物能量ATP来驱动，鞭毛马达还可以转向（从反时针旋转变为顺时针旋转）从而使菌体发生翻滚进而改变细菌的运动方向，事实上细菌在游动时也并不是单纯地一直朝前游，而是伴随着不时的随机翻滚转向，但从表观上看仍表现为细菌的前行。 细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。 3材料与方法 3.1 材料 3.1.1 菌种 枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌。 3.1.2 溶液和试剂 硝酸银鞭毛染液（A、B液），蒸馏水，95%的乙醇。 3.1.3 仪器和其他用品 普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，盖玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），接种环，试管架，镊子，吸水纸，滴管等。 3.2 步骤和方法 3.2.1 3.2.1.1 制片 先在载玻片上滴一滴蒸馏水，无菌操作用接种环由枯草芽孢杆菌（或铜绿假单胞菌）14~18h牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上挑去适量菌落边缘菌体在水中轻轻蘸几下，注意保持其不受猛烈震荡。再另取一洁净盖玻片让其一端紧靠液滴，再缓慢放下，避免产生气泡。 3.2.1.2镜检 使用光学显微镜中的油镜进行镜检，观察到两个或以上的细菌分别朝着相反或不同的方向运动时则说明细菌自身在运动。 3.2.2 鞭毛染色 洗片→95%乙醇浸泡5分钟→涂片→自然干燥→A液染色3~5min→水洗→B液冲覆盖30s~1min（稍加热）→水洗→自然干燥→镜检 3.2.2.1洗片 先用去污粉洗净载玻片约8片（每人两片），再在培养皿中倒入适量的95%的乙醇溶液，将洗净的载玻片放入浸泡5分钟。然后取出在酒精灯外焰灼烧，使其上的酒精挥发掉。 3.2.2.2 涂片 在载玻片上滴一滴蒸馏水，无菌操作用接种环由枯草芽孢杆菌（或铜绿假单胞菌）14~18h牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上挑去适量菌落边缘菌体在水中轻轻蘸一蘸，注意保持其不受猛烈震荡。倾斜玻片，使菌悬液缓慢流向另一端，用吸水纸吸去多余菌悬液，自然干燥。 3.2.2.3染色 滴加硝酸银染液A液覆盖菌面3~5min后用蒸馏水沿载