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应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定
生物技术通报
·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN ( )
2015, 31 12 :180-185
应用于 miRNA 靶标检测的双荧光素酶报告载体的
构建及鉴定
印翠 张俊玲 施志仪 孙文慧 孙近近
（上海海洋大学水产与生命学院 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： 以牙鲆空通气孔同源框2 基因 （empty spiracles homeobox 2， ）为例，构建包含 3UTR 区的野生型和突变
emx2 emx2
型双荧光素酶重组报告表达载体，以期应用于miRNA 靶标的检测。利用Trizol 法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总 RNA，参照已
克隆出来的 emx2 基因cDNA 序列，设计并合成 emx2 3UTR 片段的引物并进行 PCR 扩增，将得到的基因片段和 psiCHECK-2 载体
双酶切后，用T4 DNA Ligase 酶进行连接反应，并转化入 DH5α 感受态细胞，筛选后得到野生型重组质粒；同时采用定点诱变法对
emx2 基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴
定及测序分析。成功克隆了emx2 3UTR 区，并将emx2 3UTR 区的miRNA 靶点序列GACTTGA 突变为 AGTCCAG，成功构建了野
生型和突变型包含emx2 3UTR 区的miRNA 靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于miRNA 靶
标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体 psiCHECK-emx2-3UTR 和 psiCHECK-mutated-emx2-3UTR。
关键词 ： 牙鲆；miRNA ； ；定点诱变 ；psiCHECK- -3UTR ；psiCHECK-mutated- -3UTR
emx2 emx2 emx2
DOI ：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2015.12.026
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The Construction and Identification of Dual luciferase Reporter
Plasmids Used in miRNA Target Detection
Yin Cui Zhang Junling Shi Zhiyi Sun Wenhui Sun Jinjin
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture ，College of Fisheries and Life Science ，Shanghai Ocean
University，Shanghai 201306 ）
A
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