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1…………..流式细胞术检测细胞凋亡 Apoptosis Flow cytometry 2……….最新流式技术文献原文摘要 The latest reference in flow cytomety 3…….…跃亚时实在线技术支持服务 Online technical support is available Visit us at 流式细胞术检测细胞凋亡 Zbigniew Darzynkiewicz 凋亡和坏死 凋亡和坏死是细胞死亡的两个不同的方式。凋亡也被叫做“细胞自杀” 或“细胞程序性死亡” ，是一种细胞死亡的主动方式。凋亡通过多种复杂的机制调节细胞对环境和内在的信号的反应。(4) 细胞触发凋亡活化级联特有的分子逐级导致它的最终瓦解。最先是细胞脱水。流失的细胞水分导致细胞的大小和形态改变：最初的圆形可能变成了长形，而且通常变小了。在凋亡过程中另外一个变化是染色质浓缩。浓缩最先从核外围开始，伴随着核膜和核的破裂。核碎片核同细胞质包括完整的细胞器被包进了凋亡小体。当体内发生凋亡后凋亡体被巨噬细胞所吞噬，对临近的细胞不产生影响。 核酸内切酶活化后优先降解DNA是凋亡的特征(1,2) 。DNA降解的产物是核小体和oligonucleosomal DNA片断并且在电泳的时候产生特有的阶梯状。因此凋亡细胞的DNA部分降解的分子量，大约为180 bp (或其倍数)，很容易提取 (1,2) 。应该指出的是，在很多细胞类型中DNA降解的结果是300到50KB DNA片断，却不同于核酸内切酶的降解片断(5)。 凋亡另一个特有的特征是保存了细胞结构的完整性和大多数的细胞质膜。同样的，细胞内的器官包括线粒体和溶酶体在凋亡过程中保持其功能性(1-3)。 凋亡的特点有其他细胞的主动参与，经常包括新蛋白的合成，但是坏死是一个被动的质的过程。坏死通常表现了细胞对伤害和过量的细胞毒素试剂的反应。细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。在含水量高的细胞，可因胞质内水泡不断增大，并发生溶解，导致细胞结构完全消失，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。 应该提到的是细胞死亡不是总有凋亡和坏死的特点。细胞死亡的例子通过形态学和/或生物化学改变既不象典型的凋亡也不象坏死，但是经常有两者的特点 (6,7) 。在一些例子中，质膜很完整的保留下来，但是DNA很不规则的降解。在另一些例子中，DNA降解出现凋亡的特点但是没有出现核断裂核其他凋亡的特点。通常，造血干细胞主要是凋亡，他们的死亡出现典型的凋亡特点。上皮细胞的死亡要更加负责核难分类。 凋亡和坏死细胞的形态学特征和功能特点是基于很多流式细胞术检测描述的。我们将在下面讨论这些方法。 随着对凋亡机制的深入了解，越来越多的凋亡检测方法得到了发展和应用，应根据细胞或组织类型、凋亡诱导途径的不同，选择最佳的实验方法。凋亡最早的特征变化之一就是出现了一系列蛋白水解酶——Caspase酶。活化的Caspase酶裂解许多细胞内酶，引发凋亡细胞的特征性形态改变，这一过程的核心是Caspase-3的活化。另一个凋亡早期的变化是细胞膜对称性消失，包括质膜内侧的磷脂酰丝氨酸重新分布，由胞膜内侧翻转到胞膜外侧，而细胞膜的这种改变可以通过一种与带负电荷的磷脂高度亲和的蛋白——Annexin V来检测。凋亡晚期，另一个特征变化是核酸内切酶活化，将DNA断裂降解，使用凝胶电泳的方法，可以观察到DNA断裂片段形成的“ladder”现象。这种凋亡细胞的DNA断裂碎片，也可以通过在DNA片段末端掺入荧光标记物的方法，在流式细胞仪上进行检测此种凋亡改变，如APO-BRDU、APO-DIRECT试验就是这种方法。近年来，还发展了RiboQuant RNase Protection Assay，可以对许多凋亡相关基因进行详细的分析，将凋亡过程的研究带入了mRNA水平。 PharMingen公司提供了许多从多种角度研究凋亡的试剂系统，包括小鼠、大鼠和人类蛋白抗体：Fas和Fas配体、TRAIL和DR3/DR4、Bcl-2家族、Caspase酶家族及其它信号蛋白；再有，提供了多种流式细胞仪检测试剂盒，包括：Caspase-3 Assay Kit、APO-BRDU和APO-DIRECT Kit、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit；另外，还提供了mRNA分析试剂——RiboQuant Rnase Protection Assay系统，为小鼠、大鼠和人类的凋亡相关基