免疫学试验目录.docVIP

医学免疫学实验技术 主 编 邱玉华 副主编 居颂光 苏 州 大 学 2010年2月 目 录 1、外周血单个核细胞的……………………………………………3 2、T淋巴细胞亚群的测定………………………………………………6 3、混合淋巴细胞反应…………………………………………………10 4、淋巴细胞增殖的检测………………………………………………13 5、免疫荧光标记技术…………………………………………………15 6、小鼠血清中Ig的含量测定…………………………………………18 7、细胞因子的含量测定………………………………………………21 8、酶联免疫斑点分析…………………………………………………25 9、人外周单核细胞来源树突状细胞的制备…………………………29 10、小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的制备…………………………………32 11、多克隆抗体的制备…………………………………………………35 12、B淋巴细胞杂交瘤的建株…………………………………………37 13、细胞周期的分析……………………………………………………40 14、双向免疫扩散技术…………………………………………………42 15、免疫印迹技术………………………………………………………45 16、荷瘤动物模型的建立………………………………………………49 附件：免疫学实验常用试剂及配制方法………………………………51 实验1 外周血单个核细胞的分离(Abstraction of Peripheral blood Mononuclear Cell) 目的要求 1、掌握外周血单个核细胞分离的原理和实际操作方法。 2、掌握离心机及显微镜等仪器的使用。 二、原理 外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他血细胞不同。红细胞和粒细胞比重较大，为1.092左右，淋巴细胞和单核细胞的比重为1.075～～ 三、材料 1、肝素抗凝的人外周血。 2、淋巴细胞分离液（Ficoll）。 3、Hanks液。 4、倒置显微镜。 5、离心机。 6、华氏管、吸管、吸球、移液枪、吸头、血球计数板及盖玻片等。 四、方法 1、无菌抽取肝素抗凝外周血10ml，放入离心管中，用Hanks液稀释血液1～10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数（细胞压线时，计上不计下，计左不计右。）。将计数结果代入下式，得出细胞密度： 细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104 五、注意事项 1、温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果，Ficoll的比重在18℃～22℃时为1.077±0.001，所以在实验之前，将所需Ficoll置室温15～20min，使其温度达到18℃左右。 在Ficoll液面上加入外周血时，应缓慢加，动作要轻，以免冲散分离液面或与分离液混合而影响分离效果。 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分离液而导致血小板污染。 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片或带有气泡以免影响计数的准确性。 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml。 六、思考题 1、Ficoll分离离心时，为什么要保持适当的温度、速度和时间？ 2、从PBMC中进一步分离T、B淋巴细胞，可采用哪些方法？ （朱一蓓） 实验二 T淋巴细胞亚群测定(Assay for T Cell Subpopulation) 目的要求 掌握淋巴细胞不同亚群的常用表面标志掌握T细胞亚群测定免疫荧光法的原理和操作方法了解T细胞亚群测定的临床意义淋巴细胞是参与机体免疫调节和免疫应答的主要细胞，可分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK细胞（CD16+56+）。根据其是否表达CD4或CD8分子又可将T细胞分为CD3+CD4+T细胞亚群和CD3+CD8+T细胞亚群。在正常情况下，人外周血中各群淋巴细胞的数目和相对比例都在一定的范围内。因此T细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测,对患者的免疫功能和预后做出判断以及指导治疗。 利用不同淋巴细胞亚群特异性的表面标志，采用不同荧光标记的单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，通过流式细胞仪检测分析即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。最常检测的亚群包括T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、NK细胞（CD16+56+）、CD4+T细胞（CD3+CD4+）和CD8+T细胞（CD3+CD8+）等。 CD3+CD4+T细胞亚群 总T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD8+T细胞亚群淋巴细胞总B淋巴细胞（CD19+） 自然杀伤细胞（NK）