乙型肝炎病毒感染模型的研究现状.docx

2008年9月中国·天津乙型肝炎病毒感染模型的研究现状王选举，黄正明(解放军第302医院药学部临床药理研究室，北京100039)乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害人类健康的病毒，由于它的宿主范闱狭窄，有明显嗜肝性，体外 培养斟难，因而使得有关HBV的研究受到很大限制。如何建芷一种简便、有效、稳定的HBV感染模型对于探索其感染机制，寻找有效的防治方法及开展抗HBV药物的筛选都具有重要的意义。近年来，随着分子生 物学、病毒学和免疫学等相关学科的发展，关于HBV感染的体内外模型研究有了很大的发展，建立了多种 动物及细胞模型，为HBV的研究提供了十分重要的工具，本文现就近几年的相关研究现状作一综述。1体外模型1．12．2．15细胞系统HBV感染有高度的种属和组织特异性，它只感染人和类人猿，体外培养的人和类人猿原代肝细胞虽然可以支持HBV的复制，但细胞维持时间不长，难以推广。多年来人们一直试图通过组织培养系统来建立HBV的研究模型，随着分子生物学的发展和分子克隆技术的应用，1986年Selis等用共转染的方法将克隆的HBV—DNA(2个HBV头对尾二聚体，以尾对尾方向串联)及含有新霉素抗性基因的质粒导人人肝癌细胞系(HePG一2)中建立了2．2．15细胞株。这种细胞株一方面导人了HBV—DNA可表达伞部病毒标志，能长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dase颗粒，还能产生大量的病毒复制中间体。 另一方面，同时导人PsvT，使转染细胞具有新霉素抗性的选择表性遗传性，能使其宿主在含有新霉素的类 似物G一418的选择培养基中得以生长。而转染不成功的细胞由于不具备新霉素抗体的筛选标志『而被淘汰。2．2．15细胞的建立，为HBV—DNA的结构、功能、基因表达和调控以及体外抗HBV药物的初筛提供了有效的模型，在抗HBV药物研究中有很大的应用价值。关于2．2．15细胞是否能够分泌cccDNA，意见不一，传统观点认为该细胞株不能分泌cccDNA，但也有人报道能够在培养液中检测到cccDNA的存在J2】。2．2．15细胞为上皮样细胞形态，细胞内常有空泡且有聚集生长的现象，体外培养有附壁生长的能力网， 实验证明贴壁是此类细胞体外增殖的主要条件。但2．2．15细胞营养要求较高，细胞培养难度较大，常不易培养成功。另外，该细胞模型也存在一定的 局限性：(1)HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；(2)病毒复制的水平不能人为改变，复制水平低；(3)再现了HBV在肝细胞的复制和表达，但脱离了机体免疫系统对HBV产生影响的环境，抗HBV药可分直接抑制病毒药和通过增强免疫系统调节而间接对HBV产生抑制及清除作用，后者不能通过2．2．15细胞系为模型作为临床的实验依据。应用2．2．15细胞模型进行的药理学实验只能反映药物对2．2．15细胞HBV标志物的抑制作用，但不能揭示药物通过对免疫功能的影响而发挥间接的抗HBV作用。1．2HBV一杆状病毒一HepG2系统为克服HBV的细胞膜屏障，人们借用其他病毒的感染能力，把HBV导人到了靶细胞。Delaney等报道了一种抗HBV药物体外筛选系统，即HBV一杆状病毒一HepG2系统141。它是利用杆状病毒AutographaCalifornia将具有复制能力的HBV基因组导入到HepG2细胞，可以检测到高水平的HBV表达，包括细胞内和细胞外HBV—DNA和RNA，以及cccDNA和各种HBV抗原。病毒表达的水平和病毒的感染量(MOI)有量效关系。该系统可以控制感染的时间，在病毒复制期间或之前可 对细胞进行处理。用该系统对拉米夫定的药效进行评价，发现拉米夫定可以减少细胞内复制中间体和细胞外HBV—DNA，而且可以抑制cccDNA的表达151。但是，杆状病毒系统也有缺陷161：(1)杆状病毒进入哺乳动物细胞是通过非特异的内涵体摄取而不是受体介导方式；(2)杆状病毒感染的每个细胞内有多个HBV暨第二届肝病蔫嘉主震言思藁萋錾差棠委喜蒌论文集暨第二届肝病治疗进展与临床药学学术研讨会，巳入禾拷贝；(3)杆状病毒介导的基因转移限制在一定的种属，更重要的是不能作为动物体内实验的方法。1．3Ad—HBVl．3一HePG2系统：鉴于以上原因，He等17J以腺病毒为载体将1．3倍的HBV转入包装细胞293(人胚肾细胞)，再将包装好的病毒感染HepG2细胞，可以产生高水平的HBV表达，即Ad—HBVl．3一HePG2系统。该系统利用细菌内同源重组法将具有同源性的两个质粒pAdEasy和pAdTrack—CMV共 转化到E．coliBJ5183细胞，使腺病毒载体和目的基因HBVl．3连为一体。pAdTrack—CMV和环状的pAdEasy共转化E．coliBJ5183细胞后，用脂质体法转染包装细胞293(人胚肾细胞)。