高压液相色谱HPLC常见故障和排除方法.docVIP

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法??诊状(一)保留时间变化可能的原因 : 解 决 方 法1.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 : 用25mmol/L的缓冲液 4.柱污染 : 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 : 采用保护柱 (二)保留时间缩短可能的原因 : 解 决 方 法1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速 2.样品超载 : 降低样品量 3.键合相流失 : 流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 : 柱恒温 (三)保留时间延长可能的原因 : 解 决 方 法1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失 : 同前(二)3 4.流动相组成变化 : 同前(二)4 5.温度降低 : 同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉可能的原因 : 解 决 方 法1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏 : 更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因 : 解 决 方 法1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物 : 处理样品 3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 (六)基线噪声可能的原因 : 解 决 方 法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声) : 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) 5.检测器中有气泡 : 流动相脱气,加柱后背压 (七)峰拖尾可能的原因 : 解 决 方 法1.柱超载 : 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 2.峰干扰 : 清洁样品,调整流动相 3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品 4.同前(四)4 : 同前(四)4 5.同前(四)3 5. : 同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大 : 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管 7.柱效下降 : 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 (八)峰展宽可能的原因 : 解 决 方 法1.进样体积过大 : 同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展 : 进样前后排出气泡以降低扩散 3.数据系统采样速率太慢 : 设定速率应是每峰大于10点 4.检测器时间常数过大 : 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% 5.流动相粘度过高 : 增加柱温,采用低粘度流动相 6.检测池体积过大 : 用小体积池,卸下热交换器 7.保留时间过长 : 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 8.柱外体积过大 : 将连接管径和连接管长度降至最小 9.样品过载 : 进小浓度小体积样品 液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。一、液相色谱柱的安装：??1、液相色谱柱的结构：??a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。??柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端是3／16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7／16英寸外螺纹与1／4英寸柱管(Φ6.35mm)连接，中间放置压坏用于密封。3／16英寸的内螺纹与1／16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸)。??在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时