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柑桔属柠檬类果实果胶酯酶的活性分析 摘要: 果胶酯酶( PE 或PME) 能催化果胶脱酯生成低酯果胶和果胶酸, 属于一类果胶酶, 广泛应用于食品特别是果 品加工工业中。以新鲜柠檬为原料, 采用NaCl- 冷冻离心- 盐析的方法提取柠檬果实中的果胶酯酶, pH- stat 法对果 胶酯酶进行活性分析。研究温度、pH、相对储藏度等因素对柠檬类果实果胶酯酶的活性影响, 并探索该酶的最适温 度、最适pH 值, 进而研究该酶的热稳定性; 对柠檬果实中果胶含量进行测定。实验表明: 58 ℃, pH=6.90 时柠檬中的 果胶酯酶的活力最高。 关键词: 果胶酯酶; 柠檬; 活性 果胶酯酶( pectinesterase)( 缩写PE 1,1,11) , 国际酶委员会将果胶酯酶归类为果胶—果胶酰基水解酶。它能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇, 通过去除果胶分子链上的半乳糖醛酸羧基上的酯化基团( 主要是羟甲基或羟乙基) , 增加果胶在水中的溶解度; 所产生的果胶酸在Ca2+等离子的桥联作用下, 使细胞间的黏合加强, 从而容易形成凝胶。因此, 果胶酯酶常用于制备低甲氧基果胶以及用于果汁加工澄清等技术中。另外,果胶酯酶还能够提高食品粘度、延长货架期[1]、脱苦、去除异味和水果果皮等, 有研究发现, 果胶酯酶与植物病毒运动蛋白之间有相互联系[2- 3]。果胶酯酶在食品工业中有着极其重要的作用和开发前景。它广泛存在于一些植物如番茄、桔皮、苹果、葡萄、香蕉、梨、马铃薯、柠檬、向日葵、大豆、烟草等以及一些细胞壁降解的微生物如细菌、真菌等中。柠檬在植物学中属柑橘属类, 柠檬中含有大量的果胶酯酶, 它与细胞壁结合紧密, 主要存在于柠檬的皮、白皮层以及汁胞细胞中[4]。我国盛产柠檬, 但对柠檬皮渣的利用不够重视。柠檬皮渣不但是提取果胶的最佳原料[5], 同时也是果胶酯酶的良好来源。本文对柠檬皮及果肉中的果胶酯酶进行了生物学特性分析, 为果胶酯酶在食品工业中的应用提供依据, 同时充分利用柠檬皮渣, 变废为宝, 还可有效地保护生态环境。 1.1 材料与试剂新鲜柠檬: 市售; 果胶( JCO1 高酯果胶) : 宜昌金川生物科技公司; 氢氧化钠、氯化钠、磷酸氢二钠、柠檬酸等试剂均为分析纯。 1.2 仪器1 材料与方法 ZD- 2 型自动电位滴定仪: 上海精密科学仪器有限公司; JJ- 1 型增力电动搅拌器: 江苏省金坛市医疗仪器厂; DHG- 9075A 型电热恒温鼓风干燥箱: 上海益恒实 验仪器有限公司; JJ- 2(2003- 61)组织捣碎匀浆机: 常州国华电器有限公司; 冷冻离心机(Centrifuge5810R): Eppendorf.Inc.USA.等 1.3 方法 1.3.1 粗酶液的提取 将柠檬果肉掰瓣, 捣碎均质, 加入2 倍量的1 mol/LNaCl 溶液, 盐提。搅拌1 h 后4 ℃冷冻离心( 5 000 g,20 min) , 过滤得上清液, 然后用饱和度为75 %的( NH4) 2SO4 饱和粗酶液, 离心沉淀即得到较纯净的酶液。4 ℃下保存备用。( 柠檬皮则是洗净后切成小块, 捣碎均质, 加入4 倍量的1 mol/L NaCl 溶液, 盐提。之后处理方法和果肉一致) 。 1.3.2 PE 活力的测定 果胶酯酶催化水解果胶分子而释放出H+, 使反应体系的pH 下降, 用碱液( 0.05 mol/L NaOH 溶液) 使反 应体系的pH 始终保持在7。通过碱的消耗量可以反应出果胶酯酶的活性。测定方法: 一定温度条件下, 取30 mL 1 %的柑橘果胶溶液于100 mL 三角烧瓶中, 用0.05 mol/L 的NaOH 调pH 到7 后, 加入10 mL 粗酶液, 同时开始记时, 通过自动电位滴定仪用0.05 mol/LNaOH 滴定, 保持溶液的pH=7。以反应的NaOH 微摩尔数—反应时间作图, 由所得曲线最初部分的斜率表示果胶酯酶的活力, PE 活力单位为mol/s, 即每秒钟消耗1 mol NaOH 定义为一个PE 活力单位。 1.3.3 温度对酶活性的影响 1.3.3.1 PE 最适温度的确定 分别在30、40、50、60、70 ℃下测定PE 活力, 作活力- 温度曲线图。 1.3.3.2 pH 对酶活性的影响 在最适温度下, 分别于不同pH 条件测定PE 活力, 作活力- pH 曲线图。 1.3.3.3 PE 热稳定性研究 将PE 酶液分别在50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃温度下 分别保温, 每隔15 min 取样测定酶残余活力, 作活力-时间曲线图。 1.3.3.4 相对储藏度对酶活力的影响 将同一批柠檬储存在冰箱的保鲜柜( 5 ℃) 中, 每 隔5 d 进行一次酶活测定, 作活力- 时间曲线图。 1.3.3.5 柠檬果皮和果肉