焦磷酸测序原理和引物设计.doc

Pyrosequencing RCR 实验原理：焦磷酸测序采用生物素标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物：DNA聚合酶（合成DNA双链，释放dNTP的焦磷酸基团，释放出来的焦磷酸基团的量与和模板结合的dNTP的量成正比）、ATP硫酸化酶（在adenosine 5′ phosphosulfate存在的情况下催化焦磷酸基团形成ATP）、荧光素酶（在ATP介导下使荧光素转化为氧化荧光素，氧化荧光素能释放与ATP量成正比的可见光信号）及三磷酸腺苷双磷酸酶（降解未参入新链的dNTP及ATP，猝灭荧光）。 在测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将荧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，相应的将不会显示峰值。如下图所示： 引物设计 焦磷酸测序的模板也是经亚硫酸盐修饰后扩增，故其引物设计原则与BSP引物设计基本一致：1）引物长度在18~24碱基； 避免引物间互补或自身形成发卡结构 引物中G/C – A/T的分配比例相当，使Tm在62-65°C之间 其主要区别在于：1）Pyrosequencing的一条引物的5' 端需使用生物素标记，以和磁珠或琼脂糖beads结合，另一条引物不要标记 由于游离的生物素将会和生物素标记的PCR产物竞争结合联霉亲和素（beads）而降低信号水平，须使用HPLC纯化生物素标记的引物。 要确保PCR产物目标量大，且没有非特异性条带，也没有引物二聚体。PCR完成后使用电泳鉴定PCR产物。 PCR循环数须足够，以保证完全消耗掉引物。 Pyrosequencing 的引物设计可以直接使用PyroMark Assay Design 2.0软件进行设计。使用该软件时，只需将目的基因序列输入，该软件便可自动设计反应需要的引物，并会将CpG位点一一罗列出来，与常用的引物设计软件一样，也会有一个评分，建议使用评分在九十分以上的引物，当最高得分仍较低时，可考虑将BSR引物的其中一条进行生物素标记后使用。 PS：PyroMark Assay Design 2.0软件对目的基因的片段长度有限制，建议PCR的目的片段控制在300bp以内，测序片段控制在100bp，这样得到的结果会更加准确可靠。