实验三：线粒体与细胞核制备与观察.pptVIP

实验三 ;实验目的;实验原理;詹纳斯绿B(Janus green B);活体染色;活体染色;实验用品 ; 实验用品;实验内容;1.细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 (1）获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠,置于解剖盘中剪开腹腔,迅速取出小鼠肝,称重1克放入小烧杯内用吸管吸取预冷的生理盐水洗净血液。 (2）匀浆：将鼠肝剪碎置于预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于匀浆器中，加入10ml预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂(分次加入匀浆液)。（注：整过程在冰浴上进行） (3）过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷的小烧杯中。;（4）细胞核与线粒体分离：;上清液1与上清2合并， 11000 ×g离心10min;2.分离提取物鉴定 将共5张制片，不待干即滴加0.2%Janus greenB染色20min后（暗处反应）,盖上盖玻片，镜检，分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。如果线粒体聚集成堆则被染???深蓝色，难以辨认。 装片中的细胞核，也被染成较深的蓝色，而血细胞不着色。 注意：得到的沉淀物须加预冷0.25mol/L蔗糖缓冲液将其悬浮后再装片，制线粒体装片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。 ;实验步骤;实验步骤;实验结果;;匀浆缓冲液预冷(4 ℃) 冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直揷入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞 (适度研磨)，缩短匀浆时间。 试验全过程要在0～4℃进行,离心机温度设为 4 ℃ 整个分离过程不宜过长,要尽快。 离心机使用：离心管要平衡 g为离心力(RCF) RCF(g)=1.118×10-5 ×r ×(rpm)2 r:有效半径(cm), rpm:转速(转/分);1.分别描述五张装片的结果(如逐级分离中看到哪些细胞组分，平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少，等) 2.根据你的实验结果和你所获得的知识,你认为用此分离方法所分离的线粒体的纯度如何?有什么改进方法？ 3.绘出人口腔粘膜上皮细胞图(示线粒体的形态与分布)