四种外植体遗传转化体系的探究.PPTVIP

农杆菌介导的不同大豆外植体遗传转化体系的研究 导 师：王 罡教授 学 生：钟 影 时间：2012年11月15日 1 研究背景及目的意义 2 研究内容 3 技术路线 4 目前工作进展 5 实验进度及安排 研究背景 大豆[Glycine max( L.) Merrill］是世界上最重要的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植物性蛋白和油脂的重要来源并在维持地球生物圈氮循环具有重要的作用。 草甘膦（Glyphosate），学名N-(膦酰基甲基)氨基乙酸，只有极少数的杂草对它具有抗性，成为世界上生产使用量最大的除草剂品种。草甘膦作用机理是抑制植物体中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS）的活性，使植物体芳香族氨基酸合成受阻，致使植物死亡。 农杆菌介导的大豆遗传转化是国内外应用最为成熟、操作简便的转化方法。至今，研究者们已经利用大豆子叶节、成熟胚、胚尖、下胚轴、未成熟子叶、初生叶、花絮等获得了转基因大豆再生植株，但不同外植体的转化效率各不相同。其中，尤以子叶节、胚尖两种外植体研究较为深入，子叶节的遗传转化体系最为成熟，但转化效率没有较大突破。 目的意义 本研究旨在对国内常用的几种大豆外植体遗传转化体系进行系统研究，通过研究在农杆菌介导下，不同类型外植体在不定芽诱导率、植株再生率、除草剂敏感性及基因转化效率等方面的差异，以期获得抗除草剂大豆转基因植株并建立一种相对稳定、高效的的大豆转化体系，为进一步研究改进提供参考，为大豆的转基因育种提供技术支撑。 研究内容 除草剂筛选浓度探究 基因型：黑农37、合丰35 外植体：子叶节、胚尖、下胚轴 预期浓度梯度： 胚 尖：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L 子叶节：0、3、6、9、12、15、20mg/L 下胚轴：0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mg/L 评价指标： 不定芽诱导率、不定芽长 研究内容 胚尖遗传转化体系优化 基因型：黑农37、合丰35 优化条件 超声波辅助转化 时间：0、2、4、6、8、10min 预培养时间 梯度：0、1、2、3d 抗氧化剂 DTT、硫代硫酸钠、L-cys、硝酸银 评价指标 不定芽诱导率、基因转化效率、褐化率 研究内容 生长点非离体微创转化体系的探究 基因型：黑农37、合丰35 探究因素： 成熟胚培养时间 2、3、4、5d(根据胚轴伸长情况而定) 重悬液种类 无菌水、1/2MS盐、1/10MS盐、MS盐 转化位点 植株每个位节做PCR检测，为T1代检测做基础 评价标准 转化率、再生率 研究内容 四种外植体遗传转化体系的探究 载体：带有 EPSPS、Bar基因的PSOY20载体 基因型 黑农37、合丰35 外植体 子叶节、胚尖、下胚轴、半种子 评价标准 不定芽诱导率、植株再生率、除草剂敏感性及基因遗传转化效率 总体技术路线 分子鉴定 挑选大豆 氯气消毒 挑取农杆菌单菌落接种于YEP中，28℃摇床过夜培养 1:10扩大培养，至OD600=0.5~0.6左右 侵染 共培养 筛选、培养 收集菌体制备重悬液 外植体制备 子叶节转化过程 胚尖转化过程 下胚轴转化流程 生长点非离体微创转化体系的研究 种子萌发 共培养 光照预培养 植入蛭石 目前工作进展 黑农37（已经完成） 从上到下，从左至右，草甘膦浓度依次为：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L 胚尖遗传体系优化及转化（进入检测阶段） 成苗 生根 微创法（等待T0代种子，T1代检测） 现阶段 实验进度及安排 2012-03～2012-05 试验材料准备及农杆菌验证 2012-06 ～2012-08 除草剂浓度梯度筛选 2012-09 ～2012-11 黑农37四种外植体的转化及微创法实验 2012-12～2013-04 基因型合丰35四种外植体的转化及T0代播种 实验进度及安排 2013-05～2013-08 胚尖遗传转化体系的优化及T1代检测 2013-09～2013-12 整理实验数据，补充实验 2014-01～2014-03 开始论文撰写工作 2014-04～2014-05 种植种子，进行分子检测 2014-06 论文的撰写及答辩