D_二聚体单克隆抗体制备及其在免疫荧光快速定量检测中的应用.pdfVIP

224 中国医药生物技术 2012 年 6 月第 7 卷第 3 期 Chin Med Biotechnol, June 2012, Vol. 7, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.013 ·技术与方法· D-二聚体单克隆抗体制备 及其在免疫荧光快速定量检测中的应用 康可人，吴培钿，卢艳华，张健，唐时幸，王继华 D-二聚体（D-dimer ，D-D ）是纤维蛋白单体经活化因 箱为美国 Thermo 公司产品；SDS电泳仪购自北京 子 XIII 作用后形成的交联纤维蛋白凝块，再经纤溶酶水解 六一公司；飞测免疫荧光定量检测仪由广州万孚生物技术有 所产生的一种特异性降解产物，医学应用上将它作为一个特 限公司研制；高速冷冻离心机为日本 Hitachi 公司产品； 异性的纤溶过程标记物，反映纤维蛋白溶解功能[1] 。与纤维 ACL TOP 血凝分析仪为美国 Beckman 公司仪器，D-D 检 蛋白破坏有关的疾病，如深静脉血栓形成（DVT ）、肺栓塞 测试剂为西班牙 Werfen Group 产品。 （PE ）和弥漫性血管内凝血（DIC ）等，均可导致体内 D-D 1.1.3 临床样品来源 自 2011 年 1 月至 6 月期间，收 水平升高[2-6] 。近年来 D-D 的临床应用范围越来越广，除 集江门市五邑中医院门诊病人血浆（枸橼酸钠抗凝血，离心 了以上提及的疾病外，在恶性肿瘤、糖尿病、肝脏疾病、脓 收集血浆），共 106 例。D-二聚体含量均经血凝仪定值。 毒血症的诊断以及溶栓治疗监测方面均具有重要的参考价 1.2 方法 [7-9] 值 。 1.2.1 杂交瘤细胞株的建立 取 6 ~ 8 周龄的 BALB/c 目前 D-D 蛋白检测方法主要有胶体金法、酶联免疫吸 小鼠，首次免疫将福氏完全佐剂与等体积的 D-D 蛋白乳化 [10] 。胶 附法（ELISA ）和第二代胶乳凝集法（免疫比浊法） 后于小鼠皮下、足垫处注射，50 μg/只，经 3 次加强免疫后， 体金法快速简单，但无法实现定量检测；ELISA 法可精确 尾静脉采血，间接 ELISA 法检测小鼠血清效价，效价大于 定量，但操作步骤繁琐；免疫比浊法敏感性高，检测结果准 4 的小鼠，腹腔冲击免疫 1 次，3 d 后取其脾细胞制备杂 10 确，但试剂以进口为主[11] 。荧光免疫定量检测技术，属于即 交瘤。细胞融合按照常规半固体法进行。将离心好的融合细 [12]领域的新兴技术， 时检测（point-of-care testing ，POCT ） 胞，依次加入 FBS 、饲养细胞、HAT 溶液、半固体培养基， 能快速、灵敏、简便地实现指标的定量检测，免疫荧光定量 定容至 40 ml ，置于混匀仪上混匀 30 min 后，分别倒入 检测技术经过一定阶段的发展，目前主要在感染性指标（如 30 个培养皿中，确保半固体均匀贴皿底，装入湿盒，37 ℃， C 反应蛋白）和心脏标志物指标的应用上较为多见，厂家 5% CO2 培养箱中培养。5 ~ 7 d 后，挑选大小适中的单集 以欧美、韩为主。本研究利用杂交瘤技术制备筛选能稳定分 落克隆，转入 96 孔板培养，细胞长至培养孔面积 50% 后， 泌特异性抗 D-D 抗体的细胞株，初步应用于免疫荧光定