离子交换和亲和层析幻灯片.pptVIP

* * 5、离子交换层析 优点： ①具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大； ?有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活； ?多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。 （1）基本原理 离子交换剂是由 基质 电荷基团（或功能基团） 反离子 纤维素—O—CH2 — COO?—Na+ 反离子 基质 电荷基团 图5．羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图 每个分子能够和离子交换剂形成的静电键的数目 离子交换剂与生物大分子间的亲和力取决于: 由于不同蛋白质有不同的pI，在同一pH下，各种蛋白质所带的电荷种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用的强弱不同，有些甚至完全不吸附。从而将有不同电荷的蛋白质分开。然后通过改变缓冲液的盐浓度（离子强度）和pH，用溶液中的离子置换吸附上的蛋白质，吸附力弱的先洗脱下来，吸附力强的后洗脱下来，从而使蛋白质混合物的组分分开。 电荷数目多寡 与分子中电荷的排布有关。 1）吸附阶段： ①紧密吸附：静电键的数目相当多，以致它们同时解离的概率为零。 处于此状态的物质，被吸附于柱顶而不下移。 ②有限吸附平衡：静电键的数目较少，它们同时解离的概率达到一个有限值（0?1间）。只有在此范围内才能达到较高的分辨率。 ③解吸状态：静电键数目极少，同时解离的概率为1，完全不吸附。 2）洗脱（解吸附）阶段： 洗脱方法 增加缓冲液的离子强度 改变pH ， 洗脱方式 梯度洗脱： 阶段洗脱： （2）离子交换剂的分类和性质 离子交换剂应满足下列要求： 有高度的不溶性 有疏松的多孔结构或巨大的表面积 有较多的交换基团 有稳定的物理化学性质 离子交换剂的分型 1）阳离子交换剂 磺酸基团（-OSO3H） 甲基磺酸基团（-O-CH2-SO3 H） 乙基磺酸基团（-O-CH2-CH2-SO3H） 强阳离子交换剂 磷酸基团（-OPO3H2） 亚磷酸基团（-OPO2H） 中强阳离子交换剂? 酚羟基（- ） 羧酸（-COOH） 弱阳离子交换剂 弱酸性：R?COO–H + + Na+ R?COO– Na + +H+ 强酸性：R?S03?. H+ + Na+ R?S03?. Na + + H + 弱碱性：R? NH3 +(OH) – + Cl? 某些交换反应如下： 强碱性： R?N+ ( CH3)3 OH– + Cl? R?N+(CH3)2Cl– ? OH? R?NH3 +Cl –? OH? 2）阴离子交换剂 季胺盐[?N+ (CH3)3] 三乙基氨基乙基[-O-（CH2)2?N+ (C2H5)3] 强阴离子交换剂 叔胺[?N+H（CH3）2］ 仲胺盐(?N+H2CH3) 伯胺盐（?N+H3） 二乙基氨基乙基[-O-(CH2)2- N+H(C2H5)2] 氨基乙基[-O-(CH2)2N+H3]? 弱阴离子交换剂? 离子交换剂根据化学性质分为三类： 由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，再引入所需的酸性基团或碱性基团。 例如聚苯乙烯磺化型离子交换树脂是由苯乙烯与二乙烯苯共聚和再磺化引入磺酸基合成。磺酸根连在树脂上，氢离子与磺酸根的负电荷互相平衡，可与外来离子相互交换。 ?树脂离子交换剂： 不适用于大分子的蛋白质分离纯化 多用于小肽和氨基酸的分离纯化及无离子水的制备。 特点： 交联孔径小，吸附力太牢，要求洗脱条件剧烈 阳离子交换剂有: 羧甲基纤维素（CM- 纤维素）， 阴离子交换剂有: 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE- 纤维素） ?纤维素离子交换剂： 是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。 离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。 特点： 对蛋白质的交换容量大，结合力弱， 洗脱条件缓和， 因而是分离纯化生物活性大分子的理想的工具。 非特异性吸附少， 不易使蛋白质变性， 能引入大量活性基团而不破坏骨架 故交换容量很高 是将交换基团连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。 ?交联葡聚糖离子交换剂： 特点： 阳离子交换剂有:SE-Sephadex(强)