比较四种脱钙法对人牙免疫组化染色抗原性影响.docVIP

比较四种脱钙法对人牙免疫组化染色抗原性影响[摘要]目的：比较四种脱钙方法对人牙牙体组织免疫组化染色抗原活性的影响。方法：40颗人牙随机分为四组，分别在微波、超声、微波-超声联合及常温下用10%乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA-2Na)脱钙。应用SABC免疫组化染色技术检测Ⅰ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白在各组牙体组织中的表达情况。结果：在微波-超声联合组脱钙所需时间最短，且免疫组化染色效果最好﹙P＜0.05﹚；微波组脱钙时间较超声组略短，但二者免疫组化染色效果无显著差异（P＞0.05）。常温组所需脱钙时间最长且免疫组化染色效果最差。结论：微波-超声联合法脱钙速度较快，免疫组化染色效果较好，是一种较为理想的脱钙方法。 [关键词]微波；超声；牙齿；脱钙方法；免疫组化 [中图分类号]R783.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）06-0955-03 牙体组织结构较为特殊，其硬组织中含有大量钙盐（洛氏硬度值达340）[1]，是全身最坚硬的组织，不易切片极易脱片，因此在病理制片过程中首先要脱去其中的钙盐再进行制片，而位于牙体硬组织中心的牙髓为柔软的结缔组织，在制片过程中易受挤压、牵拉而至变形、分离甚至脱落流失，脱钙不佳也会影响组织细胞染色效果或使组织抗原丢失[2]，从而影响对病变组织的病理诊断或科学研究工作。因此合适的脱钙方法成为牙体组织制片，进行免疫组化染色实验首先要解决的难题。本实验中对微波、超声、微波-超声联合脱钙法的脱钙效果，及不同脱钙方法对牙体组织免疫组化染色抗原的影响程度进行了初步检测，旨在寻找出更适合牙体组织免疫组化染色实验的脱钙方法。 1 材料和方法 1.1 材料：收集因正畸拔除的健康人前磨牙40颗,患者年龄17～25岁,牙齿完好。经生理盐水冲洗后,入4%多聚甲醛溶液固定24h。 1.2 仪器试剂：微光波炉（WG700TL20Ⅱ-k6,广东格兰仕集团有限公司）；KQ118型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ⅰ型胶原蛋白抗体(武汉博士德公司)；纤维粘连蛋白抗体(武汉博士德公司)；SABC试剂盒(武汉博士德公司)。 1.3 脱钙液配制：10% EDTA脱钙液：EDTA-2Na 100g，NaOH 10g，加双蒸水1000ml于容量瓶中,微加温溶解，调pH值至7.2～7.4[3]。 1.4 方法：40颗牙随机分成四组：微波组（Ⅰ），超声组（Ⅱ），微波-超声联合组（Ⅲ），常温对照组（Ⅳ）。将四组牙分别放入四只250 ml小烧杯内，各加入脱钙液150～200ml。按下列四种方法脱钙：Ⅰ组：将小烧杯放入加有冷水的500ml大烧杯内；置于微波炉中（低档，输出功率150W），脱钙10min后，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅱ组：将小烧杯放入超声波清洗器中（35℃，150W），脱钙10min，取出降温5min再进行下一次脱钙，每日脱钙24次。Ⅲ组：将小烧杯放入超声清洗器中脱钙10min（条件同Ⅱ组），再放入微波炉中脱钙（条件同Ⅰ组）进行第二次脱钙，如此反复进行，每日脱钙24次。Ⅳ组：将小烧杯放于室温下静置脱钙。注意各组脱钙过程中脱钙液温度以不超过50℃为宜，各组每日更换新脱钙液一次，直至脱钙完成（以大头针无阻力可刺入组织为脱钙完成的标志）。牙齿脱钙完成后,常规石蜡包埋，唇舌向切片数张。进行免疫组织化学染色。 1.5 免疫组化染色：石蜡切片经常规脱蜡至水,蒸馏水洗5min×3次；3% H2O2室温孵育10min,蒸馏水洗5 min×3次；室温下复合消化酶消化10 min,PBS洗2 min×3次；滴加BAS封闭液,室温20 min,甩去多余液体；分别滴加一抗（兔抗人Ⅰ型胶原抗体，抗体滴度1∶50；兔抗人纤维粘连蛋白抗体，抗体滴度1∶150），4℃过夜；PBS洗2 min×3次；生物素化二抗室温孵育20 min,PBS洗2 min×3次；SABC液室温作用20 min,PBS洗5min×4次；显微镜监控下DAB显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、树胶封片,显微镜下观察。阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤同上。 1.6 图像分析及统计学处理：应用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统，运用Image-Pro-Plus图像分析软件进行平均光密度值（integral optical density，IOD）测定，取其平均值。图像分析结果以均数±标准差 (x±s)形式表示。运用SPSS13.0统计软件对所测得的数据进行方差分析。各实验组与对照组OD值之间进行Dunnett-t检验。各实验组OD值之间进行SNK-q检验。 2 结果 2.1 四种脱钙方法完成脱钙所需时间的比较 (见表1) 。 2.2 免疫组化染色结果：四种不同脱钙方法免疫组化染色效