树脂型质粒DNA小量提取试剂盒操作说明.DOC

树脂型?质粒DNA小量提取试剂盒 操作方法 将3~5ml菌液13,000rpm离心30秒收集沉淀（菌体）。 如果用1.5ml或2ml离心管则需反复离心2~3次。 倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于100μl悬浮液（溶液I）中。 上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA的产量和纯度。 加入150μl裂解液（溶液II），轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。 不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超过5分钟，否则会造成染色体DNA的污染及质粒DNA的产率降低。 加入150μl中和液（溶液III），轻柔地颠倒混匀10次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。 13,000rpm离心8~10分钟，将上清液小心转入一个新的1.5ml离心管中，加入0.4ml纯化树脂（使用前充分混匀），颠倒混匀3分钟。 此步是通过离心去除染色体DNA及细菌碎片，并使处于高盐状态下的质粒DNA与纯化树脂结合。 将纯化树脂及上清液的混和物吸入离心纯化柱中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。 将离心纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μl 80%异丙醇（或80%乙醇），13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。 如果离心纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干，否则将影响以后的酶促反应。此步是洗涤质粒DNA中混有的杂质及盐类。 重复第7步1~2次，尽可能将杂质去除。 取出离心纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml离心管，开盖放置2~3分钟，将残留的异丙醇或乙醇挥发干净。加入50μl TE缓冲液（若用于测序，则加l超纯水3分钟后，13,000rpm离心1分钟。 此步是将纯化树脂上的DNA洗脱下来。如果对质粒DNA的需求量较大的话，则重复此步骤1~2次，这样可以获得高产量的质粒DNA。TE缓冲液或无菌超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。 离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1~2μl电泳（0.8%琼脂糖，120V，15~20分钟）检测其纯度并目测定量。 若发现有RNA污染，可加入0.5μl RNase A（10mg/ml），37℃保温30分钟。此操作不影响其后续实验。 补充说明 (如果起始菌液体积较大或收集的菌体较多，溶液I、II、III的用量及其它试剂可相应放大。但操作略有不同，需要时我们乐于提供帮助。 (实验证明，少量的RNA污染对于酶切、转化及测序无明显的影响。 常见问题及参考意见 常见问题 可能原因 参考意见 质粒产量低 细胞裂解不充分 减少培养物体积。对于高拷贝质粒，培养物体积不要超过5ml，低拷贝质粒培养物体积不要超过10ml 按比例增加溶液I与溶液II的体积，使菌体充分悬浮，然后完全裂解细胞 非转化细胞的大量生长 必须在选择条件下扩增质粒DNA 定量不准确 通过琼脂糖凝胶电泳与已知浓度的质粒DNA比对 不合适的保存条件 将质粒DNA溶于无菌超纯水或TE中，于-20℃保存 菌液的放置时间过长 从培养过夜的新鲜菌液中提质粒DNA 菌液培养的时间过长 在新鲜的选择平板上挑选一个分隔良好的单菌落，于37℃振荡培养12~16小时 质粒的拷贝数太低 增加培养物体积，但不要超过10ml 溶液II及纯化树脂（于结合液中）有结晶出现 将溶液II及纯化树脂（于结合液中）置于37℃温浴30min以上，使结晶完全溶解，且在使用前要充分混匀 洗脱温度过低 加入无菌超纯水或者TE浸透树脂后，于37℃温育2分钟 洗脱液pH7.0 用TE或pH7.0的无菌超纯水洗脱 洗脱液中没有质粒DNA 质粒DNA漂出点样孔 增加甘油或蔗糖助沉 质粒丢失 在新鲜的选择平板上挑选生长良好的单克隆进行细菌培养 对质粒DNA进行重新转化 杂菌污染 在选择平板上挑选生长正常的菌落进行摇菌 电泳时质粒呈现额外条带 开环质粒DNA及线状质粒DNA的存在 加入裂解液后，轻轻混匀，时间不要超过5min 可能存在缺失突变体 有些质粒如cosmids长期保存于E.coli中是不稳定的，在摇菌时应在选择平板上挑选新鲜的，分隔良好的单克隆 存在质粒多聚体 单酶切后，质粒多聚体酶切为线状质粒DNA，可与染色体DNA的污染相区别 存在变性的超螺旋质粒DNA 加入裂解液后，碱裂解时间不要超过5分钟 RNA污染 菌体过量，导致RNase A相对量不足 减少培养菌液的体积 溶液I放置时间超过6个月 于100μl溶液I中加入1μl RNase A（10 mg/ml），或于洗脱液中加入0.5μl RNase A，37℃温育30mi