RNA干扰GRP78联合化疗药物体外抗瘤效应研究.doc

RNA干扰GRP78联合化疗药物体外抗瘤效应研究 【摘要】 目的 观察GRP78靶向RNA干扰联合化疗药物对人小细胞肺癌细胞系H446的体外抗瘤效应。方法 构建干扰GRP78质粒psiSTRIKETM/ GRP78并转染H446细胞系；采用CFSE染色和PI-AnnexinV染色，通过流式细胞术分析干扰GRP78联合化疗药物对H446细胞增殖和凋亡的影响。结果 与化疗药物单独作用相比，干扰GRP78的表达联合化疗药物共同作用能显著抑制肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡。结论：干扰GRP78的表达可有效增加小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性。 【关键词】葡萄糖调节蛋白；RNA干扰；小细胞肺癌；药物敏感性；增殖 【Abstract】 Objective To investigate the anti-tumor effects of silencing GRP78 by RNA interference in combination with chemotherapeutic drugs on H446 cells in vitro. Methods GRP78 RNA interference (RNAi) vector (psiSTRIKETM/ GRP78) was constructed by using psiSTRIKETM plasmid．The effects of psiSTRIKETM/ GRP78 in combination with chemotherapeutic drugs on apoptosis of H446 cells were evaluated by PI-Annexin V staining and dedected by FCM. The effects of psiSTRIKETM/ GRP78 in combination with chemotherapeutic drugs on proliferation of H446 cells were evaluated by CFSE staining and dedected by FCM. Conclusion RNA-interference targeting silenced GRP78 may increase the Chemosensitivity of H446 cell line． 【Key words】Glucose’regulated protein；RNA interference；small cell lung cancer；chemosensitivit；Proliferation 葡萄糖调节蛋(glucose regulative proteins，GRP)是一种内质网分子伴侣，是细胞为了适应内质网应激状态所产生的一类应激蛋白，与热休克蛋白( heat shock proteins，Hsps)有高度的同源性，因而被认为是热休克蛋白的一种。GRP的生理功能主要是协助蛋白质的正确折叠和装配。近期的研究认为，GRP类在某些肿瘤细胞中呈高表达趋势，对于肿瘤细胞的抗药性、抗原表达有重要意义。在GRP种族中，GRP78是目前研究较多且重要成员，在多种肿瘤细胞中都呈过表达趋势，以此为靶点而开展的肿瘤基因治疗及免疫治疗已成为国内外研究的热点。大量研究已经证明，GRP78在小细胞肺癌组织或细胞中呈过表达趋势，这种过表达与肺癌的发生、发展及预后有密切关系。本研究的目的就是在体外通过siRNA抑制人小细胞肺癌细胞GRP78 蛋白表达的同时联合化疗药物共同作用，观察干扰GRP78的表达能否增加小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性。 1 材料和方法 1．1Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，鼠抗人GRP78 mAb和PE标记兔抗鼠mAb均购自Santa Cruz公司，羧基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)为Sigma公司产品，PI- AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒购自Roche Diagnostics公司。 1．2　　TTTCAAGAGAACTCAATTTCAATTCTTGCTTTTTC-3’；5- TGCAGAAAAAGCAAGAATTGAAATTGAGTTCTCTTGAAACTCAATTTCAATTCTTG-3’。根据Lipofectamine2000TM试剂说明书进行。将H446细胞转种于24孔板中，37℃，5%CO2培养箱中培养24h，使细胞达到50(80%的融合；用无血清培养基分别溶解psiSTRIKETM/ GRP78和脂质体，将脂质体与核苷酸混合，室温下静置30min后，在24孔板中加入以上混合液，轻混；培养6h后弃转染液，加入完全培养基，37℃，5%CO2继续培养。 1．2．3