鲫鱼肠道对四种蛋白质饲料的体外消化与其酶解液中氨基酸吸收效率的研究.doc

鲫鱼肠道对四种蛋白质饲料的体外消化 与其酶解液中氨基酸吸收效率的研究 由于不同的饲料原料具有不同的化学结构和组成，不同种类鱼的消化功能不同，所以鱼类对各种饲料原料有不同的消化力。叶元土等利用鱼类离体肠道测定草鱼对不同饲料蛋白质的消化率和氨基酸的吸收效率，结果表明，草鱼肠道对饲料蛋白质的消化效率有较大差异，但对蛋白质水解产物——氨基酸的吸收效率并无显著性差异，从而可以认为肠道对氨基酸的吸收效率可能不受饲料种类的影响。离体消化率的测定是对饲料原料的可利用性的生物评价方法之一，具有快速、简便的优点。肠道离体灌注也是研究肠道对营养物质吸收规律的有效手段和方法。本文的主要目的在于通过蛋白质饲料的离体酶解反应和肠道的离体灌注试验，定量地分析比较鲫鱼对不同蛋白质饲料的氨基酸生成效率和肠道对氨基酸的吸收效率，探讨鲫鱼对不同蛋白质饲料消化效率、吸收效率的差异，并以此为实际水生动物配合饲料的合理配制提供参考。1 材料和方法1.1 饲料原料选择国产鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕共4种常规蛋白质饲料原料，经过粉碎机粉碎后全部通过80目标准筛。1.2 离体消化率的测定方法1.2.1 消化酶制备取在循环养殖系统中经过配合饲料养殖2周的鲫鱼20尾，平均体重126g，常规解剖得到肠道，滤纸吸干后称重，按照肠道10倍的重量加入pH值7.4、0.2mol/l的磷酸缓冲液，玻璃匀浆器匀浆，冷冻、离心（-4、10000r/min、20min），取上清液于冰箱中冷冻保存备用。1.2.2 饲料样品的酶解方法精确称取饲料样品5.000g放于250ml带塞三角瓶中，加入pH值7.4、0.2mol/l的磷酸缓冲液95ml和肠道酶提取液30ml（保持消化液体积为饲料样品质量的25倍左右）。为防止微生物的干扰加入双抗（青霉素、链霉素合剂）300mg,在30～32水浴锅中保温酶解7h。每个试验样品设置3个平行，每个试验至少重复2次。1.2.3 离体消化率计算按照1.2.2的方法分别对饲料样品酶解7h后用定量滤纸过滤，滤渣用30温水洗涤2次。将消化前的饲料样品和滤渣在70烘至恒重，精确称量滤渣质量。采用凯氏定氮法对烘干的饲料样品和消化滤渣进行粗蛋白质含量测定，按照公式计算饲料样品的离体消化率：蛋白质离体消化率（%）=（消化前饲料重量×饲料粗蛋白质含量－消化后滤渣质量×滤渣粗蛋白质含量）/（消化前饲料质量×饲料粗蛋白质含量）。1.3 酶解液氨基酸总量测定及计算方法按照1.2.2的方法分别对饲料样品进行酶解，于0、1、3、5、7h分别取酶解液0.2ml（同时补充等体积的磷酸缓冲液），加入10%的三氯醋酸0.2ml，待蛋白质沉淀后以6 000r/min 离心20min后，取上清液0.1ml采用茚三酮法测定OD570值，用亮氨酸作标准曲线计算酶溶液氨基酸的总量，再按照酶解的氨基酸总量（扣除饲料酶解前的游离氨基酸含量）占饲料量的百分比计算氨基酸的消化生成效率。1.4 用于肠道灌注的酶解液制备方法按照1.2.2的方法对鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕进行酶解7h后，取酶解液以10 000r/min离心25min,收集上清液为酶解液，于冰箱冷冻保存备用。定量取此酶解液0.2ml加入10%三氯醋酸0.2ml，待蛋白质沉淀后以6000r/min 离心20min，采用茚三酮定量测定酶解液氨基酸浓度。1.5 灌注试验方法采用叶元土等利用的肠道灌注系统进行蛋白质饲料酶解液的灌注试验。整个灌注系统置于生化培养箱中，控制环境温度在28，恒流泵控制灌注液的流量在2.00ml/min,由氧气瓶从灌流开始前5min就向培养液中充入医用氧气以保持肠道组织活性。1.6 离体肠道的制备将鲫鱼捣毁脊髓处死，立即解剖取出肠道，在生理盐溶液浸渍下剔除肠道外壁上的脂肪、血污等，在灌流系统中用生理盐溶液冲洗干净肠道内容物，置于生理盐溶液中待用。每次灌注试验用一尾鲫鱼的肠道，每次试验至少重复3遍。用于解剖获取肠道的鲫鱼平均体重为126g，试验前养殖于室内循环养殖系统中，养殖环境温度为25左右，投喂粗蛋白质为30%的颗粒配合饲料2周以上。1.7 肠道对氨基酸平均转运速度计算方法在灌注液中加入放射性酪氨酸(L-[4,5-3H]-tyr, 放射性浓度为0.5毫居里 /毫升），从灌注开始（0min）每10min取肠道外培养液0.1ml，持续40min，并取开始时肠道外培养液样品。每次取样品液100μl，取3个平行样品，并补充同样体积的生理盐溶液以保持肠道外培养液总体积恒定。取肠道内灌流液100μl于闪烁瓶内，设3个平行样品，样品液均置于闪烁瓶内，加入闪烁液5ml放置半小时后，在SN-6930液体闪烁计数器中计数（cpm值）。因灌流液的氨基酸浓度是已测知的，所以根据灌流液cpm值和肠道外培养液cpm值，就可计算出