金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗特异表达基因.doc

金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗特异表达基因筛选与体内定殖阶段cDNA文库构建 重庆大学博士学位论文 学生姓名： 指导教师：玉先 教 授 专 业：生物医学工程 学科门类： 重庆大学生物工程学院 二OO九年四月Identification of Genes Differentially Expressed by Metarhizium anisopliae Infect Locusta migratoria and Construction of cDNA Library from Metarhizium anisopliae in the Hemolymph of Locusta migratoria A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Doctor of Engineering By Supervised by yYYyProf. 导师*** Major: Biomedical Engineering College of Bioengineering OF Chongqing University, Chongqing, China April, 2009 摘 要 金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一类重要的昆虫病原真菌，在害虫生物防治中起着重要作用。与、无环境污染、安全但杀虫阻碍了真菌杀虫剂的应用绿僵菌萌发形成附着胞分泌多种蛋白酶降解昆虫体壁病原真菌致病机 EST序列分析和微阵列技术是研究昆虫病原真菌致病机理的成功策略，国内外许多研究者通过这种策略对绿僵菌侵染昆虫致病机理进行了深入研究，但采用的方法均是离体条件下，在各种液体培养基中加入诱导物培养，然后构建绿僵菌cDNA文库，大规模测序，进行EST序列分析。很明显，这些技术路线有局限性，绿僵菌在离体液体培养环境下处于腐生生，而绿僵菌侵染昆虫过程处于寄生生活阶段，离体条件下诱导培养和事实的侵染差别明显，很难对绿僵菌穿透寄主体壁，定殖寄主血淋巴适应机作出完整的诠释，从而阐明病原真菌和寄主的相互作用关系。 本研究以金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌株CQMa102和东亚飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象，从寄主血淋巴中分离出无寄主核酸污染菌体，已降解寄主核酸的东亚飞蝗翅膀诱导附着孢形成分化，抑制消减杂交技术（SSH）筛选绿僵菌在定殖血淋巴阶段的基因。D均一化和SMART技术相结合构建了金龟子绿僵菌CQMa102定殖东亚飞蝗血淋巴的全长均一化cDNA文库，大规模测序，进行EST序列分析，绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段的基因表达，以阐明寄主和病原物之间的相互作用。 主要研究结果如下： 1．观察了金龟子绿僵菌CQMa102在实验条件下侵染东亚飞蝗的致病过程发现24 h左右分生孢子穿透寄主表皮进入血淋巴，接触血细胞，引起血细胞聚集；3天～6天大量的芽生孢子被血细胞吞噬、包囊；在寄主昆虫死亡前24h左右，血细胞数量减少，芽生孢子开始迅速繁殖，血淋巴悬浮着大量酵母状虫菌体。 2．根据寄主血细胞和病原真菌细胞结构差别，建立和完善了利用蛋白酶K和SDS迅速裂解寄主血细胞的方法，整个流程时间约40min，RT-PCR检测表明利用细胞裂解释放的内源RNases和洗涤可高效去除虫菌体中的寄主核酸污染，这一结论也被后EST序列分析所证明。 3. 以寄主体内分离，去除寄主核酸污染的菌体提取mRNA为实验组（tester），使用RNA fragmentation buffer处理东亚飞蝗翅膀，降解寄主核酸，并诱导附着孢形成分化，以该的菌体提取mRNA为驱动组（driver），进行抑制消减杂交（suppression subtractive hybridizationSSH），筛选出350个阳性克隆，测序获得的EST序列经聚类分析、共拼接成120 unique ESTs其中100条singletons，20条contigs，经基因注释和功能分类，29条 (24.17%) ESTs有同源性，参与各种细胞代谢和应答过程，包括细胞代谢、蛋白代谢、细胞结构与功能以及参与胁迫和抵抗等。 4. 为验证消减效率，5个预测基因以半定量RT-PCR分析了在绿僵菌侵染东亚飞蝗不同阶段的表达水平，包括碗豆素脱甲基酶（pisatin demethylase）基因（Mpd1），(-烯醇化酶（(-enolase）基因Me1），异戊烯基转移酶prenyl transferase）基因Mpt），α-1,2甘露糖基转移酶α-1,2-mannosylt