分子生物学二研究应用篇.docVIP

基因结构与表达分析技术的基本原理 一、DNA序列分析 （一）双脱氧链末端终止法 以DNA合成反应为基础 原理：DNA合成反应中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5-P端形成3，5-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。 步骤：单链DNA模板的制备→DNA模板与测序引物退火→掺入法标记反应→延伸-终止反应（分别加入四种ddNTP）→变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→放射自显影→阅读测序结果 化学裂解法 原有DNA化学降解过程基础 原理：将待测DNA片段3′ 或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。 （三）DNA自动化序列分析 原理：采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。 步骤：4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs→Sanger测序反应→反应产物毛细管电泳分离→激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子→发射出四种不同波长的荧光→荧光信号采集→计算机分析与DNA自动排序。 二、核酸分子杂交 原理：标记的单链核酸探针与待检测的靶单链DNA或RNA局部互补结合形成杂交双链，应用于核酸靶DNA或RNA序列的定性与定量分析。 影响因素：核酸浓度长度复杂性、杂交温度、离子浓度、杂交液中的单酰胺、非特异性杂交 细胞原位杂交：是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 Southern印迹杂交（检测DNA）：将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 Northern印迹杂交（检测RNA）：指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 斑点杂交：将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。 液相杂交：1.核酸酶S1保护分析法：单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链， 加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂 交双链则受到保护而不被降解。用于RNA定量、转录起始位点、内含子剪切位 点分析。 2.RNA酶保护分析法RPA：待测RNA的分离，体外转录标记RNA探针，待测 RNA与探针RNA进行液相杂交，RNA酶消化，不同大小杂交片段凝胶电泳分离。 用于RNA定量、RNA末端定位、确定内含子位置。 3.抑制消减杂交原理SSH：以杂交为基础，并与PCR技术结合的cDNA消减杂交 方法。用于差异表达新基因的筛选与克隆。 探针：用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链（DNA、RNA），常用于鉴别、分离基因以及检测基因表达。 探针标记：同位素、地高辛、生物素 非同位素标记得优点：高灵敏，便于检测（显色反应、化学发光、荧光系），探针稳定可多次使用，无危害无污染。 探针类型及标记方法： DNA探针：随机引物标记法、缺口平移法、PCR法 cDNA探针：逆转录法 寡核苷酸探针：3端标记、3端加尾、5端标记 RNA探针：体外转录法 三、基因芯片和微阵列 基因芯片：指将许多特定DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。又称为DNA微阵列。 蛋白质芯片:将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 四、Western免疫印迹 原理：将蛋白质分子电泳分离并转移到固相支持物上，然后以偶联标记物的抗体分子作为探针进行杂交的过程。 步骤：蛋白质样品制备→DS分离→蛋白质转膜→标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交→检测并分析标记物信号 免疫沉淀技术：是一种抗原抗体反应技术，只是将抗体分子先结合到固相载体如磁珠上，然后与含目标蛋白的细胞裂解液进行液相杂交反应，利用磁场或离心等技术将结含在抗体上的蛋白质收集起来，电泳分离，用于Western blot分析。 五、 聚合酶链式反应PCR 1.原理：在模板DNA、引物、4种dNTP存在条件下，依赖DNA 聚合酶，根据细胞分裂中DNA半保留复制机理在体外快速催化扩增一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 2