牛血清实验报告.docVIP

 牛血清白蛋白的分离纯化及鉴定实验报告 作者：吴素平 魏利莎 孙锦 刘倩茹 胡健康 胡昭 （江南大学制药工程1003班） 摘 要：清蛋白，又称白蛋白（albumin,Alb）。由肝实质细胞合成，在血浆中的半寿期约为15-19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40%-60%。溶于水且遇热凝固的一种球形单纯蛋白。是一类不被50％饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。存在于动物组织、体液和某些植物的种子中。其分子量较低，溶于水，易结晶。在中性溶液中加热即沉淀或凝固。其重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麦清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。人血清（或血浆）清蛋白占血清蛋白质的55～63％，是血清中少数不含糖的蛋白质之一；分子量67500道尔顿，有584个氨基酸残基和高净电荷（等电点4.9）；与水、Ca2+、Na+、K+、脂肪酸及胆红素都有较好的结合能力。 最熟知的球蛋白是人血清球蛋白，可经电泳法分成α1-、α2-、β1-、β2-和γ-球蛋白，有免疫性。此外还有乳球蛋白、肌球蛋白等。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。可分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。其中IgG是最主要的免疫球蛋白。在体液pH7.4的环境中，白蛋白为负离子，每分子可以带有200个以上负电荷。本实验利用白蛋白带负电的性质对其采用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离提纯牛血清白蛋白。 关键字：白蛋白； 人血清白蛋白； SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 牛血清白蛋白的分离纯化 【实验目的】 掌握牛血清白蛋白分离纯化各步骤（分段盐析、离子交换层析）原理及操作方法。 【实验原理】 盐析法是一种利用蛋白质在不同浓度盐溶液中溶解度不同而分离的方法。通过将盐类加入到蛋白质溶液中，使蛋白质表面电荷被中和，水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。分段改变盐类浓度达到分离目的的方法叫分段盐析法。 DEAE-纤维素是一种应用广泛的阴离子交换剂，它本身带有正电荷，能不同程度地吸附溶液中的阴离子。层析时使用不同强度或不同PH值的缓冲溶液进行分段洗脱，含负电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，含负电荷多的蛋白质后被洗脱下来，于是不同蛋白质被分开。 【实验器材】 1.主要仪器 离心机、透析袋、磁力搅拌器、自动核酸蛋白质分离层析系统、分光光度计、水浴锅。 2.主要试剂 （1）小牛血清。 （2）饱和硫酸铵溶液：称取767g固体硫酸铵，加入1000ml水中，加热使之溶解。室温冷却后4℃静置过夜，然后用氨水将PH调至中性。 （3）固体硫酸铵。 （4）聚乙二醇20000. （5）DEAE-纤维素。 （6）双缩尿试剂：用适量蒸馏水分别溶解1.6克硫酸铜及6克酒石酸钾钠，移入1L容量瓶中。加10％NaOH300ml后，再加蒸馏水定容至1L及得。此溶液久藏不坏，但如果出现暗红色沉淀，则不能使用。 （7）0.05mol/L pH6.4PBS。 (8)0.12mol/L pH6.4PBS。 【实验方法】 硫酸铵分段盐析 量取20ml血清，倒入一干净烧杯中，缓慢加入饱和硫酸胺溶液20ml，边加边搅拌。放入4℃冰箱30分钟。 从冰箱中取出烧杯，将血清倒入一离心管，3000rpm离心20分钟。 将上清液倒入一干净量筒中，记录体积，倾入另一干净烧杯中，按17.6g/100ml的量称取固体硫酸铵，缓慢加入上清液中，边加边搅拌，4℃冰箱30分钟。 3000rpm离心20分钟，沉淀用4ml 0.05mol/L pH6.4PB溶解。 将上述液体对0.05mol/L pH6.4PB透析，过夜。 用聚乙二醇20000浓缩至2-3ml。此蛋白粗提液留待层析。 DEAE-纤维素离子交换层析 凝胶柱准备：连接自动核酸蛋白分离层析系统。夹住层析柱出口，加入1/3体积的0.05mol/L pH6.4PB，灌入层析剂，待层析剂自然沉降约2cm时，打开出口。层析柱填装完成后，盖好盖，调节适当流速，平衡过夜，等待加样。 加样用吸管吸去胶面以上的缓冲液，立即加入蛋白粗提液（沿管壁缓慢加入）。 洗脱：打开出口，待蛋白粗提液完全进入胶内后，用少量0.05mol/L pH6.4PB清洗管壁。用吸管补足层析柱胶面以上的缓冲液，用0.05mol/L pH6.4PB洗去2个层析柱体积，再换用0.12mol/L pH6.4PB洗脱并分部收集洗脱液。 检测：用双缩尿试剂检测洗脱液。有蛋白质的收集管出现紫红色，分别为第一蛋白峰和第二蛋白峰。收集第二蛋白峰处的各管，4℃冰箱保存，标记为DEAE样品。 回收层析剂。 【注意事项】 盐析所用器皿一定要干燥。 盐析时，应将饱和硫酸铵或固体硫酸铵加入到血清中，且缓慢地边加边搅拌。 层析柱上方