桑黄子实体两种新多糖分离纯化及结构探究.docVIP

桑黄子实体两种新多糖分离纯化及结构探究摘要：目的从桑黄子实体中分离具有抗肿瘤活性的多糖成分，并进行结构分析。方法热水浸提法提取桑黄子实体中的粗多糖，经醇沉、冷冻干燥、离子交换层析、凝胶层析和超滤，得到纯度较高的多糖，通过HPLC、IR、1H?NMR、13C?NMR、高碘酸氧化及Smith降解确定2种多糖的相对分子质量、组成及结构。结果分离纯化得到相对分子质量分别为14.2×103，22.2×103的多糖PL?A及蛋白聚糖PL?B，两者都是结构复杂的中性杂多糖。PL?B中，糖占71％，蛋白质占7％；PL?A，PL?B均含大量葡萄糖及少量甘露糖，PL?B中还有部分鼠李糖；PL?B所含氨基酸包括缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甘氨酸。结论多糖PL?A与蛋白聚糖PL?B为首次从桑黄子实体中提取到的多糖成分。 关键词：桑黄；多糖；纯化；结构 中图分类号：R284.2文献标识码：A文章编号： 1672?979X(2009)07?0021?05 桑黄(Phellinuslinteus)属担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，多孔菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，针层孔菌属(Phellinus)，主要寄生在桑树树干上[1]。现泛指同属的一些种类，东亚地区将其拉丁名称为Phellinuslinteus(BerkM.A.Curtis)Teng，也有些学者将产自中国的桑黄归为火木层孔菌或针层孔菌(Phellinusigniarius)[2]，或鲍氏层孔菌(PhellinusbaumiiPilat)[3]。目前不少研究表明，桑黄子实体的水提取物能明显抑制肿瘤生长，尤其对小鼠肉瘤S180有较强的的抑制作用[4]。后来研究证明桑黄中的抗肿瘤活性成分主要为多糖类物质[5]。对其活性机制的研究表明，桑黄多糖可以明显延长植入黑素瘤B16F10小鼠的寿命，减少黑素瘤B16F10的肺转移率[6]。桑黄多糖能通过增强巨噬细胞、自然杀伤细胞及B细胞的活性来抑制肿瘤的生长和转移，既是免疫增强剂，又可作为肿瘤细胞附着的直接抑制剂[7?11]。 1材料 1.1主要仪器 UV?1601PC紫外可见分光光度计(日本岛津)；十万分之一BP211D电子天平(Sartorious)；YB?2真空恒温干燥箱(天津药典标准仪器厂)；FD?1冷冻干燥机(北京博医康技术公司)；LABORATA4000旋转蒸发仪(Heidolph)；ASV?3023电子高压消毒锅(日本SAKURA)；Vivaflow200超滤包(德国VIVASCIENCE)；蠕动泵(美国MILLIPORE)；Waters2695高效液相色谱仪、2487紫外检测器、410示差检测器(Waters)；CAPCELLPAKNH2UG80色谱柱(日本资生堂)；TSKgelG3000PWXL色谱柱(日本TOSOH)；DiamonsilTMC18色谱柱(迪马公司)；FTS?65A红外光谱仪(美国Bio?Rad)；UNITYINOVA600超导核磁共振谱仪(美国Varian) 1.2试剂 乙二氨基乙基纤维素(DEAE?Cellulose，Sigma)；葡聚糖凝胶(Sephadex，G?50，Pharmacia)；右旋糖苷分子质量标准对照品(中国药品生物制品检定所)；三氟乙酸(ACROS)；对二甲氨基偶氮苯磺酰氯(DABSCl，Fluka)，Folin?酚乙试剂，牛血清蛋白(Sigma)，其他试剂均为国产分析纯。 1.3原料 桑黄子实体原料来自东南亚，批 2方法 2.1粗多糖的提取 桑黄子实体原料，粉碎后取粉末200g于3L沸水回流8h，重复3次，将滤液合并后浓缩，冷冻干燥，所得产物即水提粗多糖。加少量水溶解，加5倍体积的95％乙醇于4℃放置24h，离心收集沉淀，即得醇沉粗多糖[6]。 2.2离子交换层析和凝胶层析 DEAE?纤维素柱(4cm×60cm)经5mmolPBS(pH7.7)平衡12h，醇沉粗多糖溶于少量缓冲液后上样。先用同种缓冲液(500mL)以5mL/min流速洗涤未与阴离子交换剂结合部分，后用0.1～1.0mol/LNaCl溶于缓冲液制成的梯度洗脱液(共1000mL)洗脱与交换剂结合部分，最后以1.0mol/LNaCl?缓冲液(500mL)洗脱，每10mL收集产物，硫酸苯酚法呈阳性部分分别合并，超滤除盐，冻干[11]。 SephadexG?50凝胶柱层析(1.6cm×40cm)进一步纯化产品，凝胶柱经20mmolNaCl溶液平衡后，分别将适量冻干产品溶于该流动相后上样，按0.2mL/min洗脱，硫酸苯酚法呈阳性部分合并，超