5AzaCdR对人肾癌OSRC2细胞生长及γ连环蛋白表达的影响.docVIP

　　5AzaCdR对人肾癌OSRC2细胞生长及γ连环蛋白表达的影响 ：陶美满， 孙浩， 田福起， 马克钧， 郭涛， 潘鹏， 徐强 【摘要】 目的： 研究甲基化抑制剂5氮杂2′脱氧胞苷（5AzaCdR）对人肾癌OSRC2细胞增殖、凋亡及γ连环蛋白（γcatenin）表达的影响。方法： 使用不同浓度（10-7，10-6，10-5,10-4 mol/L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5AzaCdR处理OSRC2肾癌细胞株。MTT检测5AzaCdR对肾癌细胞株OSRC2的生长抑制作用。流式细胞仪检测5AzaCdR对OSRC2肾癌细胞株凋亡的影响。细胞免疫化学检测5AzaCdR处理OSRC2肾癌细胞株后γcatenin表达的变化。结果： 5AzaCdR明显抑制肾癌细胞的增殖，促进其凋亡，且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后γ连环蛋白表达增加。结论： γcatenin蛋白表达受甲基化的抑制，提示5AzaCdR可使γcatenin基因去甲基化而抑制肾癌OSRC2细胞株增殖，并促进其凋亡。 【关键词】 5氮杂2′脱氧胞苷； 肾癌； γ连环蛋白； 细胞凋亡; 甲基化 ［Abstract］ Objective: To investigate the effect of methylation inhibitor 5Aza2deoxycytidine on the groan renal cancer cell line OSRC2 and γcatenin expression.Methods： Human renal carcinoma OSRC2 cells ol/L） respectively.Then the groetry.The immuneocytochemistry ent ent.γcatenin expression levels in OSRC2 cells ent. Conclusion： γcatenin expression levels ethylation, 5AzaCdR can inhibit the groote the apoptosis of OSRC2 cells by inducing demethylation in the promoter region of γcatenin gene. ［Key a; γcatenin; cell apoptosis;methylation 肾细胞癌的发病率居泌尿系统肿瘤的第二位，目前的 治疗 仍以根治性手术为主，但术后复发率达20%以上，且放、化疗效果不佳，因此迫切需要早期诊断方法和其他有效的治疗［1］。肾细胞癌的发生、 发展 与多种因素有关, 抑癌基因失活是关键因素之一。研究表明, 抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等［2］。γ连环蛋白(γcatenin)是一种多功能蛋白质，近年研究显示γcatenin蛋白在多种肿瘤中表达减少, 国外有研究证实在肾癌组织及细胞其表达明显下调［3］,启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的主要方式,国内尚无相关的研究。我们采用5氮杂2′脱氧胞苷(5AzaCdR)对肾癌细胞株进行处理,检测γcatenin表达,进一步研究肾癌细胞中γcatenin表达下降是否与基因甲基化有关，探索上调或恢复肾癌细胞中γcatenin正常表达的可能机制。 1 材料与方法 1.1 材 料 人肾癌细胞株OSRC2购于上海细胞生物所；胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培养基、胰酶、DAB显色试剂盒及SABC试剂盒（武汉博士德）；5AzaCdR（Sigma 公司），用PBS充分溶解后保存于70℃冰箱备用；兔抗人γ连环蛋白多克隆抗体、MTT及二甲亚砜（Sigma 公司）；凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。 1.2 方 法 1.2.1 细胞培养 人肾癌细胞株OSRC2用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养（37℃，5％CO2，饱和湿度），隔日换液，细胞长满培养瓶壁的80％～90％后，按照1∶3传代，取对数生长期的细胞进行试验。 1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 对数生长期细胞以每孔5 000个细胞密度接种于5块96孔板中,过夜贴壁后,加入不同浓度的5AzaCdR,每孔180 μl,每组设5个复孔,并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每24 h更换1次,每天取出1板,加入5 g/L的MTT溶液20 μl,37℃，5％CO2培养箱中继续培养4 h后弃去上清,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 min充分溶解结晶,