CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响.docVIP

　　CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响 【关键词】 血管平滑肌细胞 结缔组织生长因子 细胞增殖 细胞迁移 反义RNA Abstract：Objective To specifically doigration of VSMC. Methods Primary VSMCs ethod. Anti-sense RNA technique igration of VSMC ined by MTT and scratch assay. Results Transfer of pcDNA 3.1(+)-CTGF(-) could specifically doigration of VSMC igration of VSMCs by decreasing the phosphorylation of Akt. Key ooth muscle cell (VSMC);connective tissue groigration;anti-sense RNA 动脉粥样硬化 (Atherosclerosis，AS)始于血管内膜损伤［1］。在AS发生前，常有多种因素的刺激对血管内膜造成损伤，内皮细胞发生功能性和器质性改变，造成通透性改变和分泌功能障碍，促进血液中的脂质进入动脉壁。内皮细胞和动脉中层的血管平滑肌细胞(vascular endothelial cell，VSMC)进一步激活，大量合成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖，增殖的VSMC还可迅速合成胶原等细胞外基质［2］，促使VSMC在损伤修复过程中发生纤维化，形成瘢痕修复，血管壁在结构和功能上发生了变化，最终导致了AS的形成 ［3］。 结缔组织生长因子(connective tissue groRNA和蛋白质较正常的血管内有较高表达，可见CTGF在AS的发生和发展中有着重要意义［5］。 本课题旨在探讨CTGF在AS中对VSMC增殖和迁移的影响并明确其相关机制，为CTGF对动脉粥样硬化性血管狭窄病变过程的影响提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1月龄SD大鼠由辽宁医学院实验动物中心提供。CTGF反义RNA的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CTGF(-)质粒由辽宁医学院 科学 实验中心构建。羊抗大鼠CTGF多克隆抗体， ECLTM 显影液，BCA-100蛋白质定量测定试剂盒(美国Santa Cruz 公司);Akt和磷酸化Akt抗体，平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体(美国Sigma公司);低糖DMEM 培养基(美国Gibco 公司);小牛血清，胰蛋白酶(杭州四季青生物工程公司);其他试剂均为国产分析纯产品。 霍晓川，等：CTGF反义RNA对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响辽宁医学院学报 2008年2月，29(1)1.2 实验方法 1.2.1 VSMC的培养和鉴定 处死大鼠浸于75%乙醇中消毒10 min。无菌状态取出双侧颈总动脉，去除血管外结缔组织，剖开血管，刮去内膜，剥离外膜，将中膜剪成1 mm2左右的组织块植入经明胶包被处理的培养皿中，种植密度约为1块/cm2，37 ℃、5%CO2的培养箱培养倒置培养2 h，待组织块贴壁后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，培养1周左右，待细胞爬出融合后，用0.125%的胰蛋白酶进行消化、传代，VSMC镜下见典型的“谷峰样”生长特点，平滑肌α肌动蛋白(α-actin)免疫细胞化染色阳性，证实为VSMC。选3～5代对数生长期VSMC进行实验。 1.2.2 实验分组 取培养第3～5代的VSMC细胞30瓶（5×104／mL），随机分为３组：反义RNA组，对照组及空白组，每组10瓶细胞。分别实施pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染、空白脂质体转染以及空白处理。 1.2.3 pcDNA3.1(+)-CTGF(-)转染VSMC 转染前更换无血清培养基，待VSMC生长到50%～60%后，加入含有4 μg pcDNA3.1(+)-CTGF(-)的转染复合物，置于37 ℃，5%CO2培养箱孵育。4 h后移除转染复合物，加入无血清培养基，置于37 ℃，5%CO2培养箱孵育48 h后，备用于指标检测。 1.3 指标检测 1.3.1 C长至次融合后，给予相应干预因素后，无血清DMEM培养24 h，使细胞统一于G0期，加入700 μＬ预冷的改良RIPA裂解缓冲液(Tris-HCl， 50 mmol/L， pH7.5;NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1.0 mmol/L; PMSF，1.0 mmol/L; Leupeptin， 2.0 μg/mＬ)裂解细胞，冰浴30 min，其间不时摇晃培养瓶;收集细胞，10 000