Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响.docVIP

　　Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响 ：宋萍 郑金旭 管淑红, 邵启祥 李坚 【摘要】 目的： 探讨Livin基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法： 用阳离子脂质体介导Livin ASODN转染至A549细胞，反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Livin基因 mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果： 转染ASODN后A549细胞的Livin 基因mRNA的表达明显减少，Livin 基因ASODN显著抑制A549细胞增殖，并呈剂量依赖性，与对照的错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides,MSODN)比较差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论： Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因 mRNA的表达，抑制细胞增殖，Livin基因有望成为肺癌基因 治疗 的新靶点。 【关键词】 肺癌; 反义寡核苷酸;Livin 　　[Abstract] Objective: To explore the effects antisense oligodeoxynucleotides(ASODN)of Livin mRNA on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells. Methods: Livin ASODN ediated by lipofectamine 2000. The expressions of Livin mRNA RNA in ASODN group anner. The cell groissense oligodeoxynucleotides (MSODN)(Plt;0.05). Conclusion: Livin ASODN significantly doRNA and increased groay bee a neolecular target for gene therapy for lung cancer. 　　[Key resco公司);LipofectamineTM 2000，Trizol(Invitrogen 公司);ReverAid试剂盒(Mbi公司);Ex Taq酶为TaKaRa公司产品;人肺癌细胞A549由江苏大学生命 科学 院提供。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 细胞培养 A549细胞选用含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。 　　1.2.2 寡核苷酸的设计与合成 ASODN及错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides,MSODN)序列参照 文献 [1]，由上海生工生物工程有限公司合成，并对寡核苷酸进行硫代磷酸化修饰，以提高其血清稳定性。反义序列为5′ACCATCACCGGCTGCCCAGT3′; 错义序列为5′GTCAGGATCTTCCCACGGAG3′。 　　1.2.3 细胞转染及分组 当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化接种,待细胞贴壁融合达70%，换成无血清培养基。按照LipofectamineTM2000试剂说明书将脂质体分别与ASODN和MSODN在无血清培养基中混合，制成脂质体寡核苷酸复合物(LipASODN和LipMSODN)。根据处理A549细胞的方式不同分为6组：加入LipASODN终浓度为200 nmol/L的A200组，终浓度为400 nmol/L的A400组，终浓度为600 nmol/L的A600组;加入LipMSODN终浓度为200 nmol/L的M200组;只加入脂质体的Lip对照组;同时设未加任何处理的空白对照组。细胞转染6 h后更换含血清培养基，继续培养48 h。 　　1.2.4 RTPCR 检测Livin mRNA表达 于转染后48 h收集各组细胞，用Trizol提取总RNA，经紫外分光光度仪检测总RNA浓度后，用ReverAid试剂盒获得cDNA。 参考 Livin基因序列设计引物，上游引物序列:5′CTGAGGAGTTGCGTCTGGC3′,下游引物序列：5′GCACGGCACAAAGACGAT3′,扩增片段长度为545 bp。另设计看家基因GAPDH作为内参照，上游引物序列为：5′GGATTTGGTCGTATTGGG3′，下游引物序列为：5′GGAAGATGGTGATGGGATT3′，扩增片段长度为205 bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增条件：94℃变性5 min，95℃ 30 s,55℃退火30 s,延伸 72℃ 30 s，36个