LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响.docVIP

　　LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响 ：冯艺 王笑峰 王云 罗兵 【摘要】 　　目的 探讨化学合成小干涉RNA（siRNA）对EpsteinBarr病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP1）阳性胃上皮（GT38）细胞LMP1编码基因表达的抑制作用，以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法 化学合成靶向LMP1 mRNA不同位点的3对siRNA，分别转染GT38细胞，选择干扰效果最佳的siRNA进行实验研究，行RTPCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析。结果 RTPCR结果显示，3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达，以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果最强。Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡。流式细胞分析显示，siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变。RTPCR检测结果表明，转染siRNA649的靶细胞Bcl2的表达水平降低。结论 靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达，进而可能通过抑制Bcl2的表达诱导靶细胞凋亡。GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞。 【关键词】 EpsteinBarr病毒 潜伏膜蛋白1 RNA干扰 小干涉RNA 细胞凋亡 　　［ABSTRACT］ Objective To explore the relationship betembrane protein 1 (LMP1) coding gene on the proliferation and apoptosis of EBV positive gastric epithelium cells. Methods The chemically synthetic siRNA targeting LMP1 etry arkedly inhibited the expression of LMP1 in target cells,and the effect of siRNA649 ost obvious. Apoptosis etry analysis shoically synthetic siRNA targeting LMP1 gene could effectively silence the expression of LMP1. Then it may though suppressing the expression of Bcl2 lead target cells apoptosis. This cell line can be used as a good target cell to explore LMP1 bioactivity and its effect in oncogenesis of EBV correlated tumors. 　　［KEY P1）编码基因已被确认具有癌基因的功能[2]。近年来的研究结果表明，LMP1具有介导细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能；LMP1表达还可抑制细胞分化，与鼻咽癌的低分化有关，并能促进肿瘤的侵袭和转移[3～6]。小干涉RNA（siRNA）能高效、特异地阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型。本研究选择EBV阳性胃上皮（GT38）细胞作为靶细胞，采用人工合成的siRNA特异性阻断LMP1的表达，检测LMP1沉默对GT38增殖和凋亡的影响，旨在探讨LMP1在EBV相关肿瘤发生发展中的分子机制，为EBV相关肿瘤的生物治疗提供实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清以及OPTIMEM I培养基均购自美国GIBco公司。LipofectamineTM2000和TRIzol均购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自美国Promega公司。碘化丙啶(PI)、Hochest 33258购自美国Sigma公司。 　　1.1.2 靶细胞 EBV阳性GT38细胞由日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠，用作该实验的靶细胞。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 靶向LMP1基因寡核苷酸的设计 本文靶向LMP1基因的siRNA、荧光标记的siRNA（FAMsiRNA）以及非特异性siRNA，均由广州锐博生物科技有限公司合成。经过Blast确定靶向LMP1基因siRNA的特异性及非特异性siRNA与人的mRNA无同源性。序列见表1。 　　表1 siRNA序列货号LMP1靶向位点（略） 　　1.2.2 siRNA转染效率的检测 将GT38细胞接种于2