Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.docVIP

　　Nucleostemin基因特异性RNA干扰对胃癌细胞增殖和凋亡的影响 ：郑学芝，胡静，孙卫，刘桂莲，刘晓霓，蔡子微 【摘要】 目的 探讨应用RNA干扰技术抑制nucleostemin(NS)基因表达对胃癌SGC7901细胞株增殖和凋亡的影响。方法 阳离子脂质体法将构建好的NSsiRNA表达载体转染胃癌SGC7901细胞株，采用MTT法测试各组细胞增殖抑制率；RTPCR法检测各组细胞NS基因表达情况，流式细胞术检测细胞周期，AnnexinVFITC/PI法检测细胞凋亡率。结果 与对照组相比，S组细胞的增殖减慢，24、48、72h细胞增殖抑制率分别为53.21%、71.54%、87.47%；NS基因表达量下降，G0/G1期细胞百分率显著升高(58.34%)，S期细胞减少(20.68%)，细胞凋亡率增加(26.85%)。结论 RNA干扰技术可抑制胃癌SGC7901细胞株NS基因的表达，使细胞增殖减慢，细胞周期阻滞在G0/G1期，凋亡率增加。 【关键词】 RNA干扰；nucleostemin；胃癌；细胞增殖；凋亡 ABSTRACT: Objective To investigate the effect on proliferation and apoptosis by RNA interference to inhibit Nucleostemin (NS) gene expression in gastric carcinoma SGC7901 cells. Methods The NSsiRNA expression vector a cells ineTM2000 reagent. Then etry, cell apoptosis ratio by AnnexinVFITC/PI kit. Results pared a SGC7901 cells, decrease cell proliferation, arrest cell cycle and increase apoptosis ratio. KEY I 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、DMSO购自Gibco公司。LipofectamineTM2000 Reagent、Zeocin购自Invitrogen公司。AnnexinVFITC/PI试剂盒购自BD公司。RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司。引物合成及PCR产物测序由上海申能博彩生物科技有限公司完成。 1.2 细胞培养和转染 胃癌SGC7901细胞培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37℃、50mL/L CO2潮湿空气的培养箱内培养，48h细胞贴壁后，更换培养液，然后2～3d传代1次，以维持细胞处于对数生长期。转染前1d将细胞接种到24孔板上，按每孔2×105个细胞传代。转染方法按LipofectamineTM2000 Reagent使用说明步骤进行。 1.3 单细胞细胞克隆的筛选及鉴定 PCDNA4/CNSsilencer质粒和空载体PCDNA4/Cvector质粒转染胃癌SGC7901细胞后2～3d(分别命名为S组和V组)，开始使用抗生素Zeocin(200mg/L)筛选，单克隆形成后进行扩大培养，未转染的胃癌SGC7901细胞作为空白对照(N组)。以载体上Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法鉴定细胞克隆是否外源基因整合阳性。其引物序列为：上游引物5′ATGGCCAAGTTGACCAGTGC3′，下游引物为5′TCAGTCCTGCTCCTCGGCCA3′。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，PCR产物大小约370bp，用PCR产物做琼脂糖凝胶电泳。 1.4 细胞的形态学观察 倒置显微镜下观察各组细胞形态学的变化情况。 1.5 MTT比色法测定细胞增殖抑制率 在96孔培养板上接种3组细胞，每组24复孔，每孔以1×103细胞浓度进行接种，分别于24、48、72h三个时间段进行MTT测定，每次每组测定8复孔。以培养液做空白对照并调零，用酶标仪测定490nm处的吸光度值(A值)；测3次，取平均值。 细胞增殖抑制率＝1-细胞存活率＝(1-实验组A值/空白对照组A值)×100% 1.6 各组NS基因表达水平的检测 用RTPCR方法验证各组细胞NS基因表达丰度变化。参照Genbank中NS和GAPDH的基因序列及 参考 文献 [3]，设计引物序列如下：NS基因扩增产物约570bp，上游P1：5′ATGAAAAGGCCTAAGTTAAAGAAAGC3′，下游P2：5′GCTCTCCAAATTCTCCTTTGGTA3′； GAPDH基因扩