PGIP基因真核表示和SA诱导对苹果叶PGIP基因表示之影响.docVIP

　　PGIP基因真核表示和SA诱导对苹果叶PGIP基因表示之影响 第一章 文献综述 1.1引言 病原真菌侵染植物时，植物细胞壁是第一道防线（Raman and Ravi 2011）。果胶是细胞壁的主要组分（Elad and Evensen 1995），主要由多聚半乳糖醛酸链构成（Lang andD rnenburg 2000）。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonases，PGs）是病原真菌入侵时最先分泌的一种酶（Gomathi et al. 2006），能够降解果胶层的主要组分多聚半乳糖醛酸，从而破坏植物细胞壁，造成植物感染，诱发植物发病（de Lorenzo and Ferrari 2002;Desiderio et al. 1997）。几乎所有病原菌侵染植物时都能够分泌 PGs（Albersheim andAnderson 1971）。当 PGs 分解果胶时，造成了寡半乳糖醛酸苷片段的积累，从而激活植物体的防卫系统，以对抗病原物的入侵（de Lorenzo et al. 2001; de Lorenzo and Ferrari2002; Lang and D rnenburg 2000）。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-Inhibiting Protein, PGIP)是植物细胞壁中一种富含亮氨酸重复序列(Leucine- reach repeat, LRR)的结合蛋白，能专一性地抑制真菌分泌的 endo-PG 酶活性，从而维护植物细胞壁的完整性（Turner and Hoffman 1985）。同时引起高浓度的寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonsas, OGs)在植物体内的积累，延长具有生物活性的 OGs 的稳定期，激活包括 PGIPs 在内的一系列防卫相关基因，从而激活植物体内的防御系统，增强植物的抗病性，更好地抵抗病原真菌的入侵（Albersheim and Anderson 1971; de Lorenzo and Ferrari 2002）。PGIP 与 PG 互作在植物防卫反应上作用已引起广大学者的关注。 1.2 PGIP 与 PG 互作在植物防卫反应上作用 1.2.1 PG 酶的特点 PG 酶存在于细菌、真菌、线虫和高等植物中。例如真菌灰葡萄孢属（Kars et al. 2005;Ten Have et al. 1998）、黑曲霉（Parenicovaacute; et al. 1998）、米曲霉（Kitamoto et al. 1998）、黄曲霉（Shieh et al. 1997）、灰霉菌（attei et al. 2000），推测可能与PGIPs 的热稳定性有关。 1.2.3 PGIP 与 PG 的相互作用 PGIP 是一种细胞壁结合糖蛋白，许多植物分泌的胞外 PGIP 蛋白能够特异性地识别并抑制真菌及昆虫 PGs（de Lorenzo and Ferrari 2002; D#39;Ovidio et al. 2004）。而 PG 酶具有多种不同形式，包括一级结构的不同、稳定性的差异、是否有特殊活性、最适 pH 值、作用方式的异同、底物偏爱性以及释放低聚糖的类型，使得病原真菌能适应多种宿主及环境（jygcl porrum L)中的 20 多种 PGIPs（Favaron et al. 1994）都具有抑菌功能，在一定程度上限制致病真菌的生长，并引发植物的防卫反应。不同植物的 PGIP 能不同程度的抑制同一种病原真菌分泌的 PGs（de Lorenzo et al. 2001），相同的 PGIP 也能不同程度抑制不同种类真菌分泌的PGs（周立等 1998）。但是，研究发现植物本身分泌的 PG 不能与 PGIP 相互作用，可见 PGIP 只能抑制外源 PGs 的活性（Federici et al. 2001; Torki et al. 2000）。 第二章 PGIP 基因真核表达 2.1 材料与方法 基因片段的克隆载体pMD18-T-p.p1-1，大肠杆菌DH5alpha;均为本实验室保存。毕赤酵母菌株 GS115（Pichia pastoris）、真核表达载体 pPICZalpha;B 均购自美国 Invitrogen(San Diego, CA)公司。 2.1.1 主要试剂 限制性内切酶 Kpn I、Pst I、Bsxt I、T4DNA 连接酶均购自大连宝生物公司；所用DNA Marker BioMarkerⅢ购自北京百迈克公司；蛋白质分子质量 marker 购自天根公司。 2.1.2 毕赤酵母表达溶液及培养基 2.1.2.1 毕赤酵母表达 溶液配制10 YNB：称取 13.4 g YNB 溶于 100 ml 蒸馏水中，过滤灭菌，4℃保存。500 B