siRNA沉默Annexin1基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响.docVIP

　　siRNA沉默Annexin1 基因对膀胱癌T24细胞生物学特性的影响 ：高琳 杨远航1 徐万海 林相国 李建章 杨德君 王晓民 【摘要】 目的 观察RNA 干扰技术沉默Annexin1基因表达对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响。方法 针对Annexin1基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(siRNA),脂质体介导瞬时转染膀胱癌T24细胞，转染后应用半定量RTPCR和TT法检测沉默Annexin1表达对膀胱癌T24细胞增殖的影响。结果 转染siRNA后膀胱癌T24细胞Annexin1 mRNA和蛋白水平显著下降(Plt;0.05)，转染siRNA沉默Annexin1基因表达后膀胱癌T24细胞出现典型凋亡细胞，增殖能力显著下降(Plt;0.05)。结论 RNA 干扰Annexin1基因后其mRNA 和蛋白水平显著下降，诱导了膀胱癌T24细胞凋亡，并且抑制细胞的增殖。 【关键词】 膀胱癌;Annexin1;siRNA 　　【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin1 gene ineTM2000. After transfection, expression of Annexin1 ission electronic microscope(TEM) orphology. The cellular proliferation inhibitory ratio RNA and protein. Annexin1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin1 could effectively reduce the expression of Annexin1 gene, reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis. 　　【Key bion公司。阳离子脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV购自Invitrogen 生命技术公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶购自GIBCO公司。 　　1.2 小干扰RNA(siRNA)的设计及合成 根据GenBank 中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA设计原则，应用Ambion生物公司的设计软件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密码子开始，寻找“AA”二连序列，记下其3′端的19个碱基序列作为候选的siRNA靶序列。将候选序列在GenBank中用Blast软件进行同源序列搜索，排除那些和其他基因编码序列或EST同源的候选序列。最终选择了3段21个碱基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分别靶向Annexin1基因的240260 (SI) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)区域(见表1)。另外，根据转染后细胞形态学变化，设计与TI(240siRNA)序列含有同样核苷酸比例的随机对照siRNA(240c1，240c2)做为阴性对照，用Blast验证随机序列与GenBank中其他已知人类基因序列没有同源性。利用针对三磷酸甘油醛脱氢酶(βactin)基因的正、反义寡核苷酸模板作为RNA干扰实验的阳性对照。设计的正反义寡核苷酸模板3′端均加上T7启动子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　1.3 引物的设计与合成 设计1对Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′,下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，长度 546 bp，同时设计1对管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：