α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响.docVIP

　　α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响 【摘要】 目的 检测α硫辛酸对糖尿病大鼠认知能力的影响情况，探讨α硫辛酸对糖尿病大鼠学习与记忆影响的机制。方法 orris水迷宫测试其学习记忆能力， er’s disease，AD）的发病率较非糖尿病患者增加2倍以上［2］，糖尿病合并AD的患者脑萎缩程度明显重于单纯AD的患者［1］；因此，糖尿病和AD已经成为医学和社会面临的严峻问题。虽然糖尿病是AD发病的重要危险因素之一，但对其具体的作用机制研究尚少。α硫辛酸（αlipoic acid,αLA）广泛分布于动植物等生物组织中，具有较强的抗氧化作用。有研究认为αLA可以改善糖尿病鼠血糖和氧化应激水平［3］。此外，由于αLA生物组织易吸收利用，并能通过血脑屏障，对很多脑和神经衰退性疾病可能都有一定的防治作用。基于此，本研究以STZ诱导糖尿病大鼠模型，用αLA进行干预，旨在探讨αLA对于β淀粉样蛋白的沉积、海马神经元凋亡及对糖尿病大鼠认知功能障碍的影响，以期初步揭示αLA应用于糖尿病脑病认知功能障碍的治疗机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物分组及建模方法 清洁级近交系 pH 7.4的Tris 缓冲液中)，干预2周；正常对照组和糖尿病组同期给予等量Tris 缓冲液 (pH 7.4),腹腔注射2周。 　　1.2 组织标本采集和保存 喂养16周后，摘取心脏，锡箔纸包裹后保存于-80℃冰箱； Morris水迷宫检测学习记忆能力，TUNEL检测神经元细胞凋亡情况，的圆形水池中，设置直径约10cm、高15cm的平台，平台表面低于水面2cm，先通过4天的训练让大鼠熟悉并游至平台上。第5天隐藏平台，通过记录分析系统分析处理潜伏期，考察学习能力。第6天撤去平台，进行空间搜索实验——去除平台观察2min内大鼠在中心区停留时间百分比和通过原平台位置次数，测试记忆能力。 　　1.4 in，待溴酚蓝至积层胶与分离胶交界处，换恒压100V电泳2h，使溴酚蓝全部电泳出分离胶底部。半干电转法将分离胶上的蛋白转移到经甲醇处理的PVDF膜上(12V，30min)。膜用1×TBST 溶液配制的5%脱脂奶粉（SIGMA公司）封闭12 h，再加入分别以1/400和1/600稀释的NFκB兔抗鼠抗体（SANTACRUZE，北京中山生物技术有限公司分装，1/400稀释）以及以1/400稀释的兔抗鼠βactin抗体（SANTACRUZE，北京中山生物技术有限公司分装）于4℃孵育过夜，TBST清洗3×10min，加入1/1000HRP标记的羊抗兔IgG抗体（SANTACRUZE公司生产，北京中山生物技术有限公司分装）37℃摇床上以50r/min孵育60 min，TBST清洗3×5min。用化学发光试剂盒（北京中山生物技术有限公司）检测结合的辣根过氧化物酶标记的第二抗体，X线片显影，用Quality one软件分析，以目的条带光密度/βactin光密度作为表达强度的定量指标。 　　1.5 检测细胞凋亡 将海马组织用PBS洗3次后于4%的多聚甲醛中固定25min，采用TUNEL法检测细胞凋亡情况，所用试剂盒为南京凯基生物有限公司提供。将用蛋白酶K消化后的切片用TUNEL液覆盖,37℃下孵育90min；SSC终止反应，抗HRP抗体常温孵育15min，PBS洗净，DAB呈色。光镜下凋亡细胞呈深浅不一的棕黄色。凋亡细胞半定量分析：根据凋亡细胞分布情况在400倍光镜下，每组切片拍摄7个阳性视野，每个视野计数200个凋亡的细胞，以 计算 平均凋亡细胞数所占百分比作为凋亡指数。 　　1.6 统计学方法 全部数据采用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS11.0统计分析软件进行OneWay ANOVA分析检验,Plt;0.05为显著性差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 三组细胞胞核NFκB蛋白表达 糖尿病组较之正常对照组核NFκB蛋白表达增加，有显著性差异(Plt;0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组核NFκB蛋白表达减少，有显著性差异(Plt;0.05)，见表1。 　　2.2 三组细胞浆TUNEL检测结果 糖尿病组较之正常对照组TUNEL阳性细胞增加，有显著性差异(Plt;0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组TUNEL阳性细胞减少，有显著性差异(Plt;0.05)，见表1。 　　表1 各组海马神经元凋亡率及NFκB蛋白表达比较（略） 　　a：Plt;0.05，与正常对照组比较；b：Plt;0.05，与糖尿病组比较 　　2.3 隐藏平台获得实验 糖尿病组较之正常对照组潜伏期增加，有显著性差异(Plt;0.05)。α硫辛酸组较之糖尿病组潜伏期缩短，有显著性差异(Plt;0.05) （见表2）。 　　2.4 空间搜索实验 糖尿病组较之正常对照