βcatenin依赖性LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响.docVIP

　　βcatenin依赖性 LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响 ：王淑红，南克俊，田涛，梁璇 【摘要】 目的 探讨βcatenin依赖性LEF1亚型对宫颈癌HeLa细胞生物行为学的影响。方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆全长型LEF1的编码基因，插入到真核表达载体pcDNA3.1/V5His中，脂质体法转染Hela细胞，G418筛选稳定表达目的基因的细胞株，TT和平板克隆形成实验检测转染后细胞的增殖情况，Annexin V方法检测细胞凋亡情况，裸鼠体内成瘤实验检测βcatenin依赖性LEF1亚型对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响。结果 成功构建LEF1真核表达质粒，获得稳定表达βcatenin依赖性LEF1亚型的HeLa细胞株，转染后的细胞增殖速度加快，凋亡水平降低，体内成瘤能力加强。结论 全长型LEF亚型的上调表达对于HeLa细胞的部分恶性生物学行为的发生具有一定的促进作用。 【关键词】 LEF1;增殖;凋亡;宫颈癌 　ABSTRACT: Objective To study the effects of βcatenindependent lymphoid enhancer factor (LEF1) isoforms on biological behavior of HeLa cells. Methods βcatenindependent LEF1 genes human lymphoid node cDNA library and inserted into pcDNA3.1/V5His vector to construct the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1FLEF1. Using lipofectamineTM 2000, the plasmid pcDNA3.1FLEF1 s by G418 and identified the expression of target gene ation and capability of tumor formation in vivo of transfected cell lines. Results D18T购自TaKaRa公司;脂质体LipofectamineTM 2000及细胞培养试剂均购自Invitrogene公司;鼠抗人LEF1单克隆抗体购自Chemicon公司;鼠抗人βactin单克隆抗体、羊抗鼠二抗均购自北京中杉试剂公司;MTT、DMSO购自Sigma公司;AnnexinV凋亡检测试剂盒购自BD公司;细胞培养试剂购自Gibicol公司;G418购自罗氏公司;去内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司;DNA胶回收试剂盒、PCR试剂盒、各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司。根据GenBank提供LEF1 mRNA序列(NM016269)设计LEF1截短体引物：上游5′CACAGCGGAGCGGAGATTACA3′;下游5′AAT 　　GAGCTTCGTTTTCCACCATG3′。 　　1.2 全长型LEF1真核表达载体的构建 以人淋巴结cDNA文库为模板PCR扩增全长型LEF1开放阅读框。50μL PCR体系为：1μL模板，5μL PCR缓冲液，5μL dNTP，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL rTaq酶，余用高压灭菌的去离子水补齐至50μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃末次循环7min。将PCR产物克隆到pMD18T载体中，BglⅡ和EcoRⅠ双酶切鉴定，阳性克隆命名为TFLEF1，并将其送北京奥科生物有限公司测序。测序正确的TFLEF1及真核表达载体pcDNA3.1/V5His分别经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，胶回收所需要的片段，进行连接转化和扩增，最终获得全长型LEF1的真核表达质粒：pcDNA3.1FLEF1。得到的质粒用EcoRⅤ进行酶切鉴定。 　　1.3 G418筛选稳定表达目的基因的细胞株 转染前1d将2×105细胞接种于6孔板，LEF1真核表达质粒和对照质粒定量后按照Lipofectamin2000的说明书转染HeLa细胞。细胞转染后24h按1∶5传代，G418筛选(终浓度为800mg/L)阳性克隆，常规换液，直至有单克隆细胞集落形成。挑取单个细胞克隆，在含400mg/L的G418维持浓度的DMEM培养基中筛选扩增。TT检测获得性表达全长型LEF1的HeLa细胞的活性 将1×103转染后的稳定细胞株接种到96孔板，每孔体积200μL，每组设5个复孔，