冬凌草甲素对HL60细胞凋亡及Survivin表达的影响.docVIP

　　冬凌草甲素对HL60细胞凋亡及Survivin表达的影响 【摘要】 目的 探讨冬凌草甲素对人白血病细胞株 HL60 细胞生长抑制作用及其机制。方法 收集经不同浓度冬凌草甲素干预的HL60细胞，制成细胞涂片,光学显微镜下观察细胞形态。采用MTT比色法观察不同浓度冬凌草甲素对HL60细胞增殖的抑制作用，通过凋亡试剂盒Annexin VFITC标记，流式细胞仪检测细胞凋亡率，并以RTPCR检测凋亡抑制基因 Survivin的表达。结果 冬凌草甲素在10～25 μmol/L范围内可抑制HL60细胞的生长，且呈时间和浓度依赖性。并可诱导HL60细胞发生凋亡，表现出特异性的凋亡形态学改变。流式细胞仪分析显示，冬凌草甲素处理后凋亡细胞比例增多,且随着药物浓度的增加而逐渐增加。RTPCR检测结果显示, 20 μmol/L冬凌草甲素作用后，与对照组相比， HL60细胞Survivin mRNA水平下降，且随时间延长表现得更为明显。结论 冬凌草甲素能抑制人白血病细胞株HL60细胞的生长增殖，并可诱导其发生凋亡， 其作用机制可能与凋亡抑制基因Survivin的下调有关。 【关键词】 L60 细胞；冬凌草甲素；细胞凋亡；Survivin 【Abstract】 Objective To investigate the antiproliferation effect of rebescensine A on leukemia HL60 cells and its mechanism.Methods HL60 cells in culture medium in vitro ears. MTT assay etry ine cell apoptosis rate.RTPCR o1/L) could inhibit the groe and dosedependent manner. Marked morphological changes of cell apoptosis RNA ore obviously ol/L.Conclusion Rebescensine A could inhibit proliferation and induce apoptosis of HL60 cells in vitro.One of the mechanisms may be the doRNA. 【Key g/支(C≥98%) ；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为AMRESCO产品；膜联蛋白V(Annexin V)凋亡检测试剂盒购于Biovision公司。 1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养： HL60细胞株复苏后悬浮生长于RPMI 1640培养液中，内含10%小牛血清， 1 mmol/L谷胺酰胺及青、链霉素各100 U/L。于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养， 每2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞接种于含冬凌草甲素浓度分别为5、10、15、20 、25 μmol/L的培养体系中进行实验,将细胞终浓度调至2×105/L。 1.2.2 细胞形态学观察： 收集经不同浓度的冬凌草甲素分别诱导处理24、48和72 h的HL60细胞，离心洗涤，制成细胞涂片, 干燥后瑞氏姬姆萨染色,光学显微镜下观察细胞形态。观察细胞处理后细胞膜细胞质及细胞核的变化，尤其观察凋亡小体形成等。 1.2.3 MTT 比色法检测细胞增殖抑制率:调取HL60细胞1.0×105/ml，接种于96孔培养板内，每孔100 μl，每组各设6个复孔，同时设调零孔（空白，培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。每组设定3复孔。加入冬凌草甲素使终浓度分别为5、10、15、20、25 μmol/L。置37 ℃、5%CO2温箱培养，分别诱导培养至24、48和72 h，于终止培养前4 h每孔加MTT（5 mg/ml）10 μl，继续孵育4 h。终止培养后,离心，吸去上清，每孔加150 μl二甲基亚砜（DMSO），摇匀，置摇床上低速振荡10 min，使结晶充分溶解，在酶联免疫检测仪上波长490 nm处测各孔吸光值。用空白对照调零,计算出药物对细胞生长抑制率。根据公式细胞抑制率＝1-（ 试验组OD值－空白组OD值）/ （对照组OD值－空白孔OD值）×100%=(对照组值-实验组值)/对照组值×100%，分别求得各组的细胞抑制率。 1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集不同浓度冬凌草甲素作用72 h后的HL60细胞，分别制备成0.5 ml PBS单细胞悬液,先后加入凋亡试剂盒中Annexin VFITC和PI各5 μl,室温下避光染色10 min,上流式细胞仪检测,软件分析结果，未加药组为