卡介苗经TLR4介导对膀胱癌细胞株T739NFκBp65活性影响.docVIP

　　卡介苗经TLR4介导对膀胱癌细胞株T739 NFκB p65活性影响 ：危建安, 曾星, 韩凌, 黄羽 【摘要】 　　目的: 探讨卡介苗(BCG)对膀胱癌细胞株T739 经Toll样受体介导的NFκB p65活性影响。方法: 采用SYBR Green嵌合荧光定量Real TimePCR, 观察BCG(0.25g/L)刺激T739后不同时间点各个mRNA相对表达量（Ratio）, 设LPS和空白组作对照; 采用转录因子结合DNA的ELISA方法检测NFκB p65活性。结果: BCG刺激后T739细胞TLR2、CD14和MD2 mRNA表达均明显增加, Max.Ratio分别为5.3(2 h), 2.6 (4 h), 7.4(2 h), TLR4 mRNA增加不显著, Max.Ratio为1.6（6 h）; BCG作用T739细胞后NFκB p65活性显著增加, 阻断TLR4后,NFκB p65活性受到显著抑制（Plt;0.05）; 阻断TLR2后NFκB p65活性却显著性增强（Plt;0.01）。结论: BCG作用T739后TLR2、CD14、MD2 和TLR4 mRNA表达均不同程度增加, BCG可经TLR4使T739细胞NFκB p65活性增强, 不是经TLR2使T739细胞NFκB p65活化。 【关键词】 卡介苗; 膀胱癌; 信号转导; 核转录因子κB p65 　　卡介苗(bacillus CalmetteGuérin, BCG)膀胱内灌注 治疗 和预防浅表性膀胱癌, 是目前较成功的肿瘤免疫治疗。其作用认为与BCG诱导并增强了免疫反应尤其是局部的细胞免疫有关, 但尚不能完整阐释其机制。天然免疫的研究发现［1］: 上皮、内皮细胞等可通过其表面的Toll样受体(tolllike receptors, TLRs)识别与其接触的病原微生物, 产生免疫反应。我们推测BCG也可能刺激膀胱移行上皮细胞TLRs, 通过激活Toll信号转导通路而增强抗肿瘤免疫反应。因此本研究拟用BCG刺激膀胱癌细胞株T739, 探讨其对Toll信号转导相关膜分子TLR2、TLR4、CD14和MD2 mRNA基因表达影响, 及用中和抗体分别阻断TLR2或TLR4观察NFκB 活性变化。 　 　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　实验用膀胱癌细胞株(BTTT739, 简称T739)源于小鼠低分化移行上皮细胞膀胱癌, 购自上海市第一人民 医院 中心实验室［2］, BCG为本室保存。革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)为Sigma进口分装。RNAprep cell kit、 DNase I、 TIANScript RT Kit和SYBR Green荧光染料qRTPCR试剂均购自天根生化科技公司; RNase H购自Invitrogen公司; 引物自行设计由Invitrogen公司合成; RPMI1640培养基和新生牛血清购自Gibco公司; Nuclear Extraction Kit购自Chemicon公司, 抗干扰Loetric System购自Upstate公司, TLR2、 TLR4/MD2 mAb购自Santa Cruz公司; 酶标仪(型号550, Biorad公司), 普通PCR仪和荧光定量PCR仪(型号9600和7700, ABI公司); 高速低温离心机(型号GR15S, BECKMAN公司); 凝胶成像系统(Gel doc XR型, BIORAD公司); 细胞培养箱(HARRIS公司)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 BCG和细胞培养 　　将BCG接种于Middlebrook7H9培养基中, 置于37℃静置培养, 待其生长至对数生长期使用。在使用前收集BCG, 用PBS洗涤, 称重, 用RPMI1640培养液调整培养基终浓度为0.25 g/L。T739细胞在含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培养基, 37℃、50 mL/L CO2的培养箱中培养, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代细胞。分为空白组、LPS组和BCG组共3组, 空白组不作任何处理, LPS组终浓度为100 μg/L, BCG组终浓度为0.25 g/L（ 参考 以往实验的剂量［3］）, 观察时间点为0、1、2、3、4、6、8 h、12 h等共8个, 每个时间点作3个样本, 观察指标为TLR2、 TLR4、 CD14和MD2 mRNA的表达。 　　1.2.2 总RNA提取与cDNA合成 　　总RNA提取: 采用RNAprep cell kit吸附柱提取法, 按试剂盒说明书操作, 并加用DNase I去除基因组DNA。加入30μL RNAsefree H2O收集RNA溶液。取10 μL稀释至1 mL, 用A260/A280检测总RNA浓度