枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白表达的影响.docVIP

　　枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白表达的影响 ：才春东， 姜宁，王国增，郑景存 【摘要】 　　目的 探讨枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白（osteopontn，OPN）表达的影响。方法 32只8周龄雄性ethods thirty-tale ly divided into four groups (n=8 each): normal control group、the citrate group、stone formation group（ethylene glycol(EG)and ammonium chloride）and the stone formation-citrate group.After 4 edication,the rats ination.The formation of renal stone and the expression of OPN in rat renal tissue of each group ined munohistochemistry methods.Results The formation of renal stone in the stone formation-citrate group ation-citrate group e.Conclusion Citrate can reduce crystal formation and crystal damaging on renal duct and decrease OPN expression. 　　Key L灌胃，枸椽酸钾组以25%枸椽酸钾溶液1mL·100g-1灌胃，结石组以致石剂2mL灌胃，结石+枸椽酸钾组以致石剂2mL灌胃同时用25%枸椽酸钾溶液1mL· 100g-1灌胃。各组动物每日灌胃1次，连续4周。实验结束后，取左侧肾脏，用10%甲醛固定，在肾脏中段横取2mm厚的组织块，进行梯度乙醇脱水、用二甲苯透明、浸蜡、包埋，Leitz1512切片机作连续切片4张,厚度为5μm。 　　1.3 常规HE染色 　　切片以二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。入苏木素染液5min，1%盐酸乙醇溶液分化5s，自来水蓝化30min，1%伊红染液1min，各级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 　　1.4 免疫组化 　　对大鼠肾组织的石蜡切片，厚度5μm，行免疫组化染色：① 切片以二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2室温孵育消除内源性过氧化物酶的活性；② 磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，0.01mol·L-1柠檬酸缓冲液做抗原修复；③ 滴加兔抗OPN多克隆抗体（1∶200稀释，每次实验均设2张阴性对照,以PBS代替一抗)，4℃过夜；④ PBS冲洗，滴加二抗，室温30min；⑤ PBS冲冼，DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。 　　1.5 显微镜观察 　　用Olympus光学显微镜(×400)观察各组别的常规HE切片及免疫组化切片。HE切片 “-”表示无结石及结晶沉淀物;“+”表示少量结晶沉淀物;“++”表示有结晶沉淀物，有时可见游离结石形成;“+++”表示有大量的结晶，并有游离结石形成。免疫组化切片按“+”表示肾小管胞浆轻度染色(浅黄色);“++”表示肾小管胞浆中度染色(黄色);“+++”表示肾小管胞浆明显染色(深棕黄色)。随机选取5个视野进行分级并统计分析。 　　1.6 统计学方法 　　数据采用SPSS 13.0统计软件，采用Kruskal-ann-whitney非参数检验进行组间两两比较。 　　 2 结果 　　2.1 大鼠肾脏病理切片中草酸钙晶体形成情况 草酸钙结晶在常规病理切片为无色透明晶体。本实验中对照组和枸橼酸钾组大鼠肾小管未见扩张和草酸钙晶体沉积（如图1A、B，见封2）；结石组大鼠部分肾组织肿胀，表面点状分布黄白色结晶或钙化，镜下见多数管腔内存在弥漫散布无色透明，大多呈连续片状结晶,皮质多于髓质,结晶体主要位于近曲小管和远曲小管，上皮细胞明显肿胀、变性、坏死，管腔内可见嗜伊红样染色坏死物质及部分脱落上皮细胞，且肾间质有炎性细胞浸润（如图1C，见封2）；枸橼酸钾+结石组肾小管腔仅见较少散在草酸钙结晶存在，管腔扩张程度较轻（如图1D，见封2）。大鼠肾脏成石程度分级结果详见表1。表1 各组大鼠肾脏成石程度分级（略） 　　2.2 免疫组化结果 OPN在所有4组中均有表达，在肾近曲小管和远曲小管、亨利氏袢和集合管(主要髓袢升支)均明显表达，而在皮质肾小球中则未见表达。对照组OPN微弱表达（图2A，见封2）；枸橼酸钾组OPN呈微弱表达（图2B，见封2）；结石组大鼠肾组织中OPN表达增强（图2C，见封2）；结石+枸橼酸钾组肾组织OPN的表达（图2D，见封2）强于对照组，较结石组弱。大鼠肾脏骨桥蛋白程度分级结果详见表