生物分离与纯化技术(生化工艺)第2章预处理及固液分离.pptVIP

* * * * * * * 影响细胞破碎的因素 搅拌速度（700～1450r/min） 料液的循环速度（50～500L/h） 细胞浓度（0.3～0.5g/mL） 珠粒大小和填充量 （0.45～1mm；70％～90％) 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果极差。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困难的。 超声波法 电声超声波发生器 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂 酸碱调节pH，改变蛋白质的电荷，使其与其他物质作用力下降 有机溶剂能大量渗透进入细胞，造成细胞膨胀破碎 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 ，常用于无色杆菌、芽孢杆菌、梭菌、假单胞杆菌破碎 表面活性剂能使脂溶性成分溶解而是胞内物质渗漏出来 化学法 优点：①细胞外形较完整，碎片少，②核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离、不需要专门设备，③对产物的释出选择性好等优点，故使用较多。 缺点：易导致活性物质破坏、化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难 化学法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性强，发生酶解的条件温和。 缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。 溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 酶解法 渗透压冲击 是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。 冻结-融化法 将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。 对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。 机械破碎法与非机械法比较 破碎方法的选择 破碎目标——待破碎细胞的机械强度 破碎条件——目标产物对破碎条件的敏感性 细胞的量 破碎率的测定 1.直接测定法：细胞计数 2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率 第3节 发酵液的固液分离 固液分离的目的： 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等。 过滤 影响过滤的因素： 发酵液的性质：黏度、粒度、颗粒含量、滤饼的性质 过滤装置：过滤面积、料液分布效果 过滤操作条件：压力、过滤方式 过滤 改善过滤的方法 (一）预处理：改善发酵液性质 （二）助滤剂：能改善过滤操作的质地坚硬不可压缩性固体 机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构 助滤剂选择：粒度与悬浮颗粒适当 使用方法： a 预先制成滤饼：滤液澄清度高 b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤：容易达到滤速最大 c 两种方法混用 常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭 （三）优化过滤装置 板框压缩机 鼓式真空过滤机 过滤的常用设备： 转鼓真空过滤机 ? Dry Wash Immersion Knife Cake Feed Rotary vacuum filter 转鼓真空过滤机 离心分离 借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术 细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离 超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生物大分子的重要手段之一 (1)利用物质的不同密度进行分离 (2)离心方式多： 离心沉降、离心过滤、差速离心、速率区带离心、密度离心等 (3)应用广: a活体生物离心(细胞、微生物、病毒) b细胞器离心(细胞核、细胞膜、线粒体) c生物大分子离心(核酸、蛋白质、酶、多聚物) d小分子聚合物合物等。 特点： 差速离心 差速沉淀离心(differential centrifugation)系指分步改变离心速度，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分批沉淀分离的方法，它适用于沉降系数差别在一到几个数量级的混合样品的分离，对于差别较小的物质，差速离心难以得到满意的分离效果。 等密度离心 保证絮凝效果最佳 碱化 分离实例 乳酸发酵液预处理 80℃保温3min 发酵液 变性去除