FISH光原位杂交操作说明.doc

简便、快捷、准确－临床诊断中的FISH检测 ?? FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FISH的操作。 ??? 探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb－400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原－抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。 ??? FISH检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。 ??? 我们以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例，简要介绍FISH的原位杂交过程。AneuVysion多色DNA探针试剂盒用于羊水细胞的产前诊断，样本是来源于羊水的细胞。试剂盒通过两组5种探针（LSI13/21和CEP18/X/Y）同时检测5个染色体的数目异常，以此为依据进行产前诊断。 样本的制备 1000转/分离心羊水（AF）5分钟。羊水应没有血色或褐色。 用2-5ml的1×胰酶/EDTA溶液（0.05%胰酶，0.53MEDTA4Na的Hank氏平衡盐溶液，不含CaCl2、MgCl2.6H2O、MgSO4.7H2O）悬浮沉淀，37℃水浴15分钟以上 1000转/分离心5分钟 用2-5ml的0.56%KCl溶液悬浮细胞，37℃水浴20分钟。这些处理步骤的目的是使羊水细胞成为悬浮的单细胞。 加0.8-2ml的固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）至细胞低渗液中，轻轻混匀 1000转/分离心悬液5分钟，用1ml新的固定液重新悬浮细胞。4℃保存固定的样本30分钟以上，直至FISH检测前。若要长期保存，-20℃保存在固定液中 制片前根据悬浮细胞数调整悬液的体积。若储存时间超过一个月以上，在制片前用固定液清洗细胞 直接滴加细胞悬液至1-2片预冷的玻片上，每片2个杂交区(每个区域15-25μL细胞悬液) 　 样本的老化（目的是为了使FISH达到最佳效果） 将样本片子放入2×SSC37℃1小时 将片子放入新制的胃蛋白酶工作液中（20μL10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl）37℃13分钟 用磷酸盐平衡液（PBS）室温下清洗5分钟 将片子放入快速固定液（0.95%甲醛：1ml的37%甲醛，0.18gMgCl2和39ml的PBS，4℃保存，一个月内使用）室温5分钟 在室温下用PBS清洗5分钟 晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片 将片子浸泡在70%的乙醇中。用乙醇冲洗1分钟 从70%乙醇中取出，依次放入85%、100%乙醇中重复以上步骤 根据需要降解片子 　 样本DNA的变性 片子的制作前将湿润的杂交盒（盒的边缘用1×3英寸的杂交膜或杂交纸密封）放入37℃孵箱内预热至37℃ 在科普林氏染色缸中加入变性溶液，73±1℃水浴30分钟以上。使用前测量温度。 每次使用前测定变性溶液的PH值，确保在7.0-8.0之间。将样本片子浸泡入73±1℃变性溶液中5分钟降解样本的DNA。每个染色缸中的片子不能超过4张。 用镊子拿出片子立刻放入室温的70%乙醇洗液中，漂洗片子除去甲酰胺。片子放入乙醇溶液中一分钟 从70%的乙醇中拿出片子，依次放入85%、100%乙醇中重复上述步骤 用吸水纸从玻片的底部吸去多余的乙醇，并抹干片子的外缘 在加入探针溶液前将片子加热至45-50