Cys突变体凝血VIII因子的蛋白质反式剪接Trans-splicing-药学学报.PDF

·734 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (6): 734−738 Cys 突变体凝血VIII 因子的蛋白质反式剪接 * 朱甫祥 , 刘泽隆, 缪 静, 屈慧鸽, 迟晓艳 (鲁东大学生命科学学院, 山东 烟台 264025) 摘要: 为改善蛋白质反式剪接效率, 将 B- 区缺失型FVIII (BDD-FVIII) 重链的 Tyr664 和轻链的 Thr1826 突变为 Cys, 双载体共转 COS-7 细胞, 观察了细胞内蛋白质剪接、二硫键形成和细胞培养上清液中分泌的剪接 BDD-FVIII 量和活性。Western blotting 检测结果显示, Cys 突变可在细胞内形成链间二硫键, 剪接 BDD-FVIII 蛋白量明显增 加; 双夹心 ELISA 检测分泌的剪接 BDD-FVIII 为 (128 −1 −1 ± 24) ng·mL , 明显高于对照 (89 ± 15) ng·mL ; Coatest 法检测结果显示, 细胞分泌的凝血活性为 (0.94 ± 0.08) u·mL−1, 也明显高于对照 (0.62 ± 0.15) u·mL−1 。结果表明, 链间二硫键形成可显著提高基于蛋白质剪接的双载体转 BDD-FVIII 基因作用, 为进一步动物体内实验提供了依 据。 关键词: 凝血 VIII 因子; 蛋白质反式剪接; 双载体; 转基因; Cys 突变 中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2012) 06-0734-05 Trans-splicing of Cys mutated coagulation factor VIII * ZHU Fu-xiang , LIU Ze-long, MIAO Jing, QU Hui-ge, CHI Xiao-yan (Life Science College of Ludong University, Yantai 264025, China) Abstract : To investigate the improving effect of inter-chain disulfide formation on protein trans-splicing, we introduce a Cys point mutation at Tyr664 in heavy chain and at Thr1826 in light chain of B-domain-deleted FVIII (BDD-FVIII). By co-transfection of COS-7 cell with the two Cys mutated chain genes, the intracellular protein splicing, inter-chain disulfide formation, secreted BDD-FVIII and bioactivity in culture supern