RNA提取试验操作步骤注意事项及问题指引准备试剂：氯仿异丙醇.DOC

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南 准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。 操作步骤： 1. 匀浆处理 a. 植物组织: 以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol. b. 动物组织: 以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%. c. 单层培养细胞. 直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次. 注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染. d.细胞悬液: 离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。 e.血液处理: 直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。弃上清，收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。 2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min，取上清。 如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。 4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。如不能涡旋混匀，可手动颠倒混匀2min代替。 5. 4 ℃ 10 000rpm离心10-15min，样品会分成三层：红色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约600ul，约为所用Trizol试剂的60%）转移到新管中。（如要分离蛋白质和DNA，可保留黄色的有机相） 6. 在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃ 放置20-30min。 植物或动物组织RNA提取中，容易沉淀出大量的蛋白等污染物，导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染：在上清中加入1/2体积的异丙醇，1/2体积的RNA助沉剂，然后进行以下操作。 7. 4 ℃ 10 000rpm离心10min，去上清。 离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。 8. 加入1ml 75%乙醇（DEPC水处理过的水配制）洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。 9. 4 ℃ 10 000rpm离心2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。 10. 室温放置晾干（不要晾得过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3min左右即可）。加入适量DEPC水（根据实验需要，可加30-100ul水）或0.5%SDS，用枪头吸打几次，充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。 注意事项： 1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ： 加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 ℃放置一个月以上： RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存，RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中，-70 ℃长期保存。 预防RNase污染，应注意以下几个方面： 1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。 2. 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。 3. RNA在Trizol试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150 ℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 4. 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至中浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。 不同组织或细胞RNA提取预期得