荧光原位杂交及其应用.PDF

荧光原位杂交及其应用 荧光原位杂交(FISH)法是80 年代才开始应用的细胞分子生物学中的 一种重要的非放射性原位杂交方法。它对检测细胞内DNA 或RNA 的某种特定序列的存在与否最为有效。FISH 在基因定位,染色体鉴别, 细胞内检测特定DNA 或RNA 的存在等细胞遗传学,遗传工程学以及 医学等广泛研究领域中都起着越来越重要的作用。这里仅以果蝇培养 细胞中的组蛋白基因检测实验为例,说明FISH 的特点及操作过程等。 1 FISH 法的特点在FISH 法出现以前使用的多为放射性原位杂交法。 此法的灵敏度较高,但有几个主要的缺点:首先要求具备使用放射性同 位素的专用实验室。实验周期长而且背景深,常使结果分析复杂化。 再有,用放射性同位素标记的探针不易保存,实验后放射性废液的处理 也很麻烦。FISH 法的主要特点正是克服了放射性原位杂交的这些缺 点:不需要特殊实验室,无放射污染危险,标记探针可长期保存,实验周 期短并且其灵敏度与放射性原位杂交相比毫不逊色。利用荧光强度测 定装置还可以进行定量检测。2 FISH 法的操作过程2.1 制备探针 以DNA 探针为例。现有果蝇的组蛋白基因DNA(5 kb), 以此DNA 作为模板制作探针。本实验中使用的是用生物素以PNR 法制备的单 链探针。2.2 显微镜标本的制片 ( 以培养细胞为例) 。(1)准备:果蝇 培养细胞(10 5～10 6/ml);低渗液:0.075 mol/L KCl;琼脂糖液:用 低渗液溶解的0.5%低融点(20～30℃)琼脂糖;洁净的载玻片,用PAP 笔 ( 日本DAIDO SANG YO 株式会社)在载玻片的中央部位画一个直 径约1.5 cm 的圆圈;潮湿盒;固定液( 甲醇∶冰醋酸=3 ∶1)。(2)操作: 取培养细胞1 ml 于微离心管中,1 500 r/min 离心5 min,去上清, 用PBS 洗细胞1 次,加预热至25 ℃(25℃为果蝇细胞的培养温度) 的低 渗液 150μ l,再加150μ l 预热至25 ℃的琼脂糖液充分混合,滴到几张 预热至25 ℃的载玻片上的圆圈内,水平放在25 ℃的潮湿盒内静置30 min 。之后,取出载玻片使之垂直除去多余的液体,插入固定液内在室温 固定30 min,取出后风干备用。以新制备的标本为好。如需保存,应 放在-20 ℃下,使用前再以同样方式固定一遍。2.3 原位杂交2.3.1 准 备(1)细胞标本的杂交前处理:把上述固定好的标本放在60℃烤箱中干 焙3 h,之后进行下列各步操作:①RNA 消化处理:消化液组成:4 份用 量,每份75μ l 。1μ g/μ l Rnase A 30μ l(0.1μ g/μ l)50 × Denhardt 溶液12μ l(2 ×Denhart)20 ×SSC 30μ l(2 ×SSC)DDW 228 μ l 合计300μ l 混合后放置在冰水中待用。消化处理方法:在样品细胞 上加RNA 消化液75μ l,把玻片平放在潮湿盒内,在37℃反应1 h 。用 上述固定液固定30 min,风干。②盐酸处理:标本玻片在PBS(不含 Ca++、Mg++离子, 以下同) 中浸泡10 min,之后移入0.2 N 的HCl 中浸泡20 min,用PBS 浸洗3 次,每次5 min 。全部在室温下进行。 ③蛋白质消化处理:消化液组成:2 mg/ml proteinase K 1 μ l(2μ g/ml)60 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)333μ l(2 m mol/L)10 mmol/L CaCl 2 200μ l(2 m mol/L)DDW 466μ l